DNA异常甲基化与结直肠癌研究进展

DNA异常甲基化与结直肠癌研究进展

文章发表于：《广西医学》

作者：1. 刘纲毅 、张明明（广西科技大学附属柳州市人民医院） 2. 黄志卓（广西医科大学第四附属医院柳州市工人医院）

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【摘要】

结直肠癌是常见的一种恶性肿瘤，其主要发病机制为不可逆转的基因系列改变以及可逆转的表遗传修饰。DNA甲基化是肿瘤发生的重要表观遗传学变化，并已被证实与结直肠癌的发生发展密切相关。本文就结直肠癌遗传学机   制以及结直肠癌相关基因的DNA异常甲基化在结直肠癌中的发生、诊断与治疗中的研究情况进行综述，总结通过分子诊断技术利用结直肠癌相关基因的DNA异常甲基化作为生物标志物，用于结直肠癌的无创性筛查、早期检测、诊断、预测和预后的进展，为结直肠癌的诊疗提供新的方法和思路。

【关键词】 结直肠癌；表遗传学修饰；脱氧核糖核酸；甲基化；筛查；诊断

结直肠癌是最为常见的恶性肿瘤之一，全球每年新诊断病例超过100万，其死亡率超过30%[1-2]  o美国癌症协会统计显示，2013年美国约诊断14万新发结直肠癌患者和约5万结直肠癌死亡患者[3] 。结直肠癌的发生发展是一个涉及多因素和多步骤的复杂而缓慢的过程，除与饮食习惯、生活方式、生活环境等外界因素有关外，结直肠癌主要的发病机制涉及不可逆转的基因系列改变，和可逆转的表遗传修饰。表遗传学是指发生在可遗传的基因表达上的修饰而未涉及DNA系列的改变。基因表达的表遗传调控可发生在正常组织并在胚胎发育、基因印迹和细胞分化中起着重要的作用。表遗传机制目前被认为在肿瘤中扮演重要角色，主要包括DNA异常甲基化、组蛋白翻译后修饰、微小RNA和非编码RNA等[4]。本文主要对DNA异常甲基化在结直肠癌中的发生、诊断与治疗中的研究情况进行综述。

1. 结直肠癌的遗传学机制

结直肠癌患者多为散发性病例，20% ~ 25%的结直肠癌患者具有家族史，但仅5% ~ 6%的结直肠癌患者与主要的高外显率结直肠癌基因遗传性突变(遗传综合征)相关。结直肠癌遗传综合征主要包括遗传性非息肉性结直肠癌和家族性腺瘤性息肉病。而75%~80%的散发性结直肠癌病例多由易感性基因和环境因素相互作用引起[3-6]。遗传学表现为基因系列发生点突变、插人缺失突变等变化而弓起基因表达的改变。引发结直肠癌的突变基因包括原癌基因抑癌基因和DNA错配修复基因，原癌基因主要有大鼠肉瘤病毒癌基因同源物( V-KI-RAS2 Kirsten  rat sarcoma viral oncogene homolog， KRAS)和鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体(v-Rafmurine sarcoma viral oncogenehomologueB1，BRAF)，抑癌基因主要为结肠腺瘤样息肉( adenomatosis polyposis coli， APC)蛋白、肿瘤抑制蛋白( tumor protein p53 ，TP53 )和Sma-Mad族蛋白2/4( Sma-andMad-related protein， SMAD)， DNA错配修复基因主要为MutL同种蛋白1( mutL homolog-1， MLH1 )和Mut S同种组织蛋白2( mutS homolog 2， MSH2)。这些基因的突变导致相关信号通路的异常，如位于表皮生长因子受体( epidermal growth factor receptor， EGFR)的原癌基因KRAS的信号通过BRAF激活受体络氨酸介导的一系列多个信号通路[3，7-13]，基因组的不稳定则加速基因突变的累积，导致癌细胞持续增殖。在结直肠癌病例中至少存在两种基因组不稳定形式：微卫星不稳定性( microsat-ellite instability， MSI)和染色体不稳定( chromosomalinstability ， CIN)。在散发性结直肠癌中，约15%的患者存在MSI，85%的患者存在CIN[14]。

2. 结直肠癌常见相关基因的异常甲基化

DNA甲基化是最具特征性也是最为重要的表遗传学修饰，是指由DNA甲基转移酶催化，把S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到核苷酸对( cytosine-phosphate-guanine ，CpG)二核苷酸的胞嘧啶5位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶从而影响基因表达的过程[15]。

2.1 DNA甲基化与结直肠癌

在正常基因组上，70% ~ 80%的CpG均发生甲基化，而CpG岛(启动子上富含CpG的区域)通常未发生甲基化[16-18]。在肿瘤组织上则相反，表现为全基因组的低甲基化和启动子区域，特别是抑癌基因启动子的过度甲基化[15]。全基因组的低甲基化可引起基因组的不稳定及可激活正常情况下沉默的基因区域如原癌基因15，191，启动子区域的过度甲基化则使抑癌基因、DNA修复基因、细胞周期控制基因、调亡基因等发生异常沉默[20-21)。研究表明，结直肠癌可有多种基因的异常甲基化[6.22-23]， 笔者总结了与结直肠癌相关的甲基化基因，见表1和表2。这些基因的启动子发生高甲基化后被沉默，进而促进结直肠癌的形成与发展。肿瘤组织的多启动子甲基化可形成CpG岛甲基化表型( CpG island methylator phenotype ， CIMP) ，CIMP与老年、女性、结直肠癌家庭史、近端结肠、黏液性细胞的分化、特异性癌前病变、吸烟、MSI及KRAS和BRAF突变相关”。结直肠癌可根据CIMP的存在或缺乏及关键基因突变分为不同的型别[24-25]  就表遗传学观点而言，结直肠癌可分为CIMP +和CIMP -，并建议分为3个亚群：(1)CIMP1肿瘤，常表现为MSI( 80% )和BRAF 突变(53% )；(2)CIMP2肿瘤，常见KRAF突变(92% )，但少见MSI、BRAF突变或TP53突变；(3)CIMP-肿瘤，该亚群TP53突变出现频率较高[24]，最近研究显示，高CIMP亚群肿瘤出现频率非常高的肿瘤特异性DNA高甲基化，并且与MLH1基因甲基化、BRAFV600E突变，以及女性相关；低CIMP亚群肿瘤与KRAS突变和男性相关；CIMP-亚群肿瘤表现为TP53突变，但肿瘤特异性基因突变和高甲基化的频率较低且常发生在末端结肠和直肠， BRAF和KFAS基因为野生型[25 -26]。

结直肠癌的发生和发展是一个多步骤的过程，DNA异常甲基化可贯穿于肿瘤发展的所有阶段，如表2所示。研究显示，至少有6种甲基化基因(SLC5A8、SFRP1、SFRP2、CDH13. CRBP1和RUNX3)和2个甲基化位点( MINT1和MINT31 )存在于正常结肠上皮组织到异常肠隐窝病灶阶段[22]；其他一些基因( p14、HLTFITGA4、CDKN2A/p16、CDH1和ESR1 )常发现于从异常肠隐窝病灶到息肉或腺瘤的阶段；而TIMP3、CXCL12、ID4和IRF8基因可出现在息肉到癌变组织的阶段；DNA修复基因MGMT和hMLH1甲基化在从息肉到癌变的过程亦起着重要的作用。基质细胞中编码SPARC基因的甲基化与结直肠癌的淋巴管浸润转移相关[27]。

表1  与结直肠癌相关的常见甲基化基因

表2 DNA异常甲基化与结直肠癌诊断进展、预后和治疗分类

2.2  DNA甲基化与结直肠癌筛查和诊断 

 结直肠癌是一种具有高死亡率但癌前阶段时间较长的肿瘤，如果能够在高危人群建立大规模的筛查，就可以得到早期的诊断与治疗。研究表明，如果在未发生转移的局部病变的结直肠癌早期阶段得到诊断与治疗，患者5年生存率超过90%，明显高于已发生转移的晚期结直肠癌患者的11 %[28 -30]。结直肠癌的筛查方法一般分为两种：(1)基于结构上的检查和基于粪便或外采血液标本的检测，前者如各种肠镜检查，是一种侵入性的检测方法，但可检测早期癌变和腺瘤性息肉；(2)基于粪便或外采血液标本的检测包括潜血、免疫化学检测和脱落细胞DNA检测，这些方法为无创性的检查，但具有较低的敏感性。粪便或外周血浆DNA检测是唯  种以分子生物标志物为检测物，分子生物标志物较潜血等具有更高物特异性。SEPT9、VIM、TMEFF2、ITGA4、ALX4和HLTF等均是与结直肠癌有较高相关性的基因，且可能过甲基化特异性PCR( methylation -specific PCR， MSP)或巢氏甲基化特异性PCR( hemi-nested methylation-specific PCR ， hn-MSP)或荧光定量MSP(quantitativeMSP，qMSP)及甲基化敏感高分辨率熔解曲线( methylation -sensitive high resolution  melting，MS-HRM)从血液或粪便中检测 [31 - 38]。

SEPT9基因与细胞质分裂相关，其有特殊的结构特征并且在多种肿瘤中存在差异表达。SEPT9 基因启动子甲基化是近年来发现的比较特异的结直肠癌标志物。血浆或粪便中检测SEPT9基因启动子甲基化对结直肠癌的敏感度可在70%以上，特异性在83%~94%[31 -36]有研究显示，术前结直肠癌患者血浆中SEPT9启动子甲基化检测阳性率为95.6%，I~V级结直肠癌的SEPT9阳性率达100.0%，I级为84.0%，特异性为84.8%；而在行结肠镜检查前的无疾病迹象样本的阳性率为15.6%，特异性为99%[33]；该研究还显示，粪便潜血试验和癌胚抗原( carcino embryonic antigen， CEA)在结直肠癌患者的敏感性分别为68.2%和51.8%，特异性分别为70.6%和85.2%，作者认为SEPT9启动子甲基化检测在结直肠癌的诊断中优于粪便潜血试验和CEA。另外，结直肠癌特异性生物标志物VIM基因甲基化检测的敏感度和特异性也可达到80%左右[39 -40]，因此在进行结直肠癌早期筛查时，可联合检测多种特异性相关标志物，进一步提高结直肠癌诊断的敏感性和特异性。
在甲基化检测方法方面，MS-HRM的最低检测限为1%，优于MSP技术的5%，但nMSP和qMSP可提高最低检测限[34、41]。赵慧霞等[42]应用nMSP联合变性高效液相色色谱技术检测SEPT9基因可行到较好结果。

2.3  DNA甲基化与结直肠癌治疗 

有学者[43]研究发现，一些异常甲基化基因可引起癌细胞对治疗结直肠癌的常用3种药物(氟尿嘧啶、伊立替康和奥沙利铂)的敏感性或耐药性发生变化。氟尿嘧啶的抗肿瘤活性主要是抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶( thymidylate synthase，TYMS)， 对氟尿嘧啶产生耐药的主要机制是增加TYMS基因的表达。有证据表明，TYMS基因启动子甲基化对 TYMS表达的调节比组蛋白乙酰化/去乙酰化更具相关性[43]  其他一些参与嘧啶代谢的基因也可能是氟尿嘧啶产生耐药的潜在分子因素，如二氢嘧啶脱氢酶(dihy-dropyrimidine dehydrogenase ， DYPD)基因、胸苷磷酸化酶( thymidine phosphorylase ， TYMP)基因和尿苷-磷酸激酶( uridine monophosphate kinase ， UMPK)基因。DNA启动子甲基化也是影响这些基因表达的主要机制。研究表明，SPARC基因表达水平下调同样也可降低化疗药物(包括氟尿嘧啶和伊立替康)的敏感性，SPARC基因持续甲基化存在于结直肠癌组织中，但在正常结肠组织未发现甲基化[44]。伊立替康是拓扑异构酶1的抑制剂，UDP葡萄糖醛酸基转移酶1A1 ( UDP-glucuronyl transferase ，UGT1A1 )对伊立替康具有脱毒作用，伊立替康的药物基因组学主要基于UGT1A1的基因表型[45]，体外实验表明，DNA甲基化可使UGT1A1基因沉默；也表明该基因发生表遗传学修饰可能与伊立替康治疗结直肠癌的敏感性相关[43]

3. 结语

结直肠癌的发生发展是遗传学与表遗传学相关基因发生改变和修饰及环境因素共同作用的一个缓慢过程。虽然本文主要综述了结直肠癌相关基因的DNA异常甲基化，但表遗传学的其他机制如组蛋白翻译后修，饰、染色质重建、RNA介导的机制和遗传学方面的相关基因突变、插入/缺失等也在结直肠癌的发生发展中起：重要作用。DNA异常甲基化的研究，对于结直肠癌的诊断、分期、转移倾向、预后和治疗等提供了新的方法和思路，并且已经在我们面前展现了良好的前景。

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