方法：应用 Transwell 小室招募实验检测不同处理条件下对人急性单核细胞白血病细胞系（THP-1）招募能力改变；使用 Western blot 测定 CXCL5、PARP/cleaved-PARP 蛋白水平改变；通过 qRT-PCR 检测 CXCL5 的 mRNA 水平改变；使用 MTT 实验测定巨噬细胞及多柔比星处理对膀胱癌增殖能力的影响。

结果：膀胱癌细胞相对正常膀胱上皮细胞招募更多的 THP-1（P <0.05）；膀胱癌细胞相对正常膀胱上皮细胞 CXCL5 在蛋白水平和 mRNA 水平表达上调（P <0.05）；膀胱癌细胞中 CXCL5 敲减能抑制膀胱癌细胞对 THP-1 细胞的招募能力（P <0.05）；巨噬细胞与膀胱癌细胞共培养后再加入多柔比星 cleaved-PARP 上调减弱，细胞存活率增加（P <0.05）。

结论：膀胱癌细胞能分泌 CXCL5 招募过多的巨噬细胞促进膀胱癌化疗耐药。

【关键词】膀胱癌；趋化因子生长调节基因 5 ；巨噬细胞；多柔比星耐药；

膀胱癌是泌尿系统常见肿瘤之一，因其发病率高、术后复发率高以及致死率高等特点导致膀胱癌治疗颇为困难 [1]。膀胱癌微环境在肿瘤进展和治疗中发挥重要功能 [2]，肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages， TAMs）是肿瘤微环境的重要组成部分，相对于癌旁组织，肿瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞明显增加，被激活为 M2 型巨噬细胞后释放大量细胞因子，促进膀胱癌的进展 [3]。

趋化因子生长调节基因 5[chemokine（C-X-C motif）ligand 5， CXCL5] 属于趋化因子 CXC 中 ELR 趋化因子的一员，最新研究发现 CXCL5 具有促进肿瘤增殖、血管形成、粒细胞趋化及促进炎症反应等功能 [4-5]，本研究旨在探究膀胱癌通过分泌 CXCL5 招募巨噬细胞以及巨噬细胞对膀胱癌化疗耐药性的影响，为膀胱癌治疗提供新的诊疗思路。

1 材料与方法

1.1 材料

人正常膀胱上皮细胞 SV-HUC-1、人膀胱癌细胞系 T24、253J 及人急性单核细胞白血病细胞系 THP-1 细胞购自中国科学院昆明细胞库，DMEM 培养基和RMPI-1640 培养基购于美国 Life Technologies 公司，胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司，佛波酯（phorbol 12-myristste 13-acetate， PMA）、IL-4 购自美国 Sigma-Aldrich 公司，Transwell 小室购自美国Coming 公司，Fibronectin 购自美国 Life Technologies 公司，RNA 提取试剂盒购自上海飞捷生物技术有限公司，RNA 反转试剂盒及PCR kit 购自日本TaKaRa 公司， CXCL5 敲减 shRNA 慢病毒购自上海吉凯基因化学技术有限公司，CXCL5 多克隆抗体购自美国 Santa Cruz 公司，PARP/cleaved-PARP 购自美国 Cell Signaling Technology（CST）公司。

1.2 细胞培养及 shRNA 慢病毒转染

膀胱癌细胞 T24、253J 使用含 10% 胎牛血清DMEM 培养基培养，人正常膀胱上皮细胞 SV-HUC-1 和急性单核细胞白血病细胞系 THP-1 细胞使用含10% 胎牛血清 RMPI 1640 培养基培养，培养基内加入 100 μg/ml 青霉素和链霉素（Sigma， USA），置于 37℃、5% 二氧化碳 CO2 培养箱，每 2 ～ 3 天对细胞换液处理，贴壁细胞每 4 ～ 5 天通过胰酶消化进行传代处理，THP-1 细胞离心重悬进行传代处理。每次实验前使用 160 nmol/L PMA 细胞培养 24 h，诱导 THP-1 细胞分化成巨噬细胞。shRNA 慢病毒预实验感染确定T24 细胞 MOI 值为 5、253J 细胞 MOI 值为 10。调整细胞密度将 T24、253J 细胞接种于 6 孔板中，转染前用 DMEM 培养液清洗细胞，使用 Complete Mdeium 稀释 polybrene 至终浓度 50 μg/ml，细胞加入 5 μg/ml 的polybrene 和相应体积病毒转染T24、253J 细胞 48 h 后，使用 2 ～ 3 μg/ml 嘌呤霉素进行细胞筛选 2 ～ 3 周，荧光显微镜下检测荧光蛋白表达，实时荧光定量 PCR 和 Western blot 检测 CXCL5 的 mRNA 和蛋白表达。

1.3 人正常膀胱上皮细胞和膀胱癌细胞条件培养基提取

人正常膀胱上皮细胞和膀胱癌细胞正常培养，胰酶消化离心后重悬，调整细胞数量为 2.0×106 个/皿接种于 10 cm 皿中，待细胞贴壁后更换无血清培养基，将 10 cm 皿置于 37℃、5% CO2 培养箱培养 48 h，吸取细胞上清液离心去除细胞碎屑，吸取离心后上清液置入 -20℃冰箱冷冻保存备用。

1.4 THP-1 源性巨噬细胞条件培养基提取

THP-1 细胞离心重悬，细胞计数并按 2.0×106 个/ 皿接种于 10 cm 皿中，PMA 诱导培养 24 h，更换新的培养基，再加入 20 ng/ml 的 IL-4 继续培养 24 h，更换无血清培养基，置于 37℃、5% CO2 培养箱培养 48 h，吸取细胞上清液离心去除细胞碎屑，吸取离心后上清液置入 -20℃冰箱冷冻保存备用。

1.5 四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测膀胱癌细胞增殖能力变化

膀胱癌细胞正常培养，待细胞生长至 70%~80% 消化进行细胞计数，调整细胞密度为 3.0×105 个 /ml，按照每孔 200 μl 接种于 96 孔板中，待细胞贴壁后实验组按照 1 ∶ 1 比例加入巨噬细胞条件培养基共培养36 h，加入浓度为 2.0 μmol/L 多柔比星，每种处理设置 5 个复孔，将 96 孔板置于 37℃、5% CO2 培养箱培养 24 h，吸去上清液，每孔加入含有 10% MTT 的培养基培养 4 h，吸去上清液加入 150 μl DMSO/ 孔，置于微量振荡器匀速振荡 10 min，对照组未加入巨噬细胞条件培养基。应用酶联免疫检测仪在 490 nm 处检测光密度（OD）值，做出细胞生长曲线。

1.6 THP-1 细胞招募实验

取 5μm Transwell 小室，倒置放置于 10 cm 皿中，小室下室膜上滴加 20 μl Fibronectin 并均匀铺满，放置于 37 ℃、5% CO2 培养箱中 4 ～ 6 h 备用。THP-1正常培养，离心后使用无血清培养基重悬，细胞计数并调整细胞密度为 2.5×105 个 /ml，取出已包被 Fibronectin 的小室取出置于 24 孔板中，小室下室加入 1 ∶ 1 稀释的无血清条件培养基，上室加入 200 μl 的THP-1 细胞悬液，将 24 孔板置于 37℃、5% CO2 培养箱培养 36 h，棉签擦拭小室上室细胞，使用 4% 多聚甲醛固定 20 min，PBS 清洗加入结晶紫染色 20 min，再次使用 PBS 清洗小室并使用棉签擦拭上室残留细胞，显微镜随机选取 5 个视野拍照，实验重复 3 次。

1.7 实时荧光定量 PCR 检测相关 mRNA 表达

使用胰酶消化并传代细胞接种于 6 孔板中，待细胞密度至 60% ～ 70% 时按照飞捷 RNAfast 200 试剂说明书操作提取 RNA，cDNA 模板通过 RNA 逆转录获得，逆转录体系参照 TaKaRa Prime ScriptTM RT Master Mix 试剂说明书。CXCL5 的 mRNA 表达检测使用TaKaRa SYBR @ PrimixEx TaqTM Ⅱ反应体系，引物序列，正向5'-GACGGTGGAAACAAGGAAAA-3'，反向GCTTA AGCGGCAAACATAGG- -3'。使用ß -actin作为内参，正向
5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC- 3'，反向5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。mRNA的表达水平采用2△△Ct 计算方法进行分析。T24和253J两种细胞系未加入CXCL5敲减shRNA慢病毒作为对照。

1.8 Western blot 检测相关蛋白表达

使用胰酶消化并传代细胞接种于 6 孔板中，待细胞密度至 60% ～ 70% 时加入细胞裂解液提取蛋白，使用 BCA 法测定所提取蛋白浓度。取 30μg 蛋白使用 SDS-PAGE 凝胶进行分离并转膜处理，PVDF 膜使用 5% 脱脂牛奶常温封闭 1 h，加入目的抗体 CXCL5、PARP/cleaved-PARP、β-actin，放置在 4℃冰箱摇床慢摇过夜孵育。使用 TBST 洗膜液洗膜 10 min×3 次，加入二抗孵育，并置于常温摇床 1 h，TBST 洗膜液洗膜 10 min×3 次，使用 ECL 显影液进行显影。目的蛋白表达量通过与内参蛋白 β-actin 标准化后得到相对比值。

1.9 统计学方法

数据分析采用 SPSS 18.0 统计软件，计量数据以均数 ± 标准差（x±s）表示，对计量资料组间比较采用多因素方差分析及 LSD-t 检验，P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌细胞与正常膀胱上皮细胞招募 THP-1 细胞

SV-HUC-1 组招募 THP-1 细胞数（85.400±5.528），膀胱癌细胞 T24 和 253J 组招募 THP-1 细胞数分别为（288.200±6.028）和（348.600±8.583），与正常膀胱上皮细胞比较，差异有统计学意义（t =42.950和 44.650，均P =0.000），显示膀胱癌细胞相对正常膀胱上皮细胞招募更多的 THP-1 细胞。

2.2 膀胱癌细胞与正常膀胱上皮细胞 CXCL5 表达水平

T24 组与 253J 组膀胱癌细胞 CXCL5 的 mRNA 表达水平分别为（5.871±0.345）、（6.238±0.472），与正常膀胱上皮细胞（1.000±0.413）比较，差异有统计学意义（t =15.680 和 14.470，均P =0.000），CXCL5在膀胱癌细胞中表达升高。见图 1。

2.3 膀胱癌细胞 CXCL5 敲减对 THP-1 细胞浸润的影响

敲减膀胱癌细胞 CXCL5 表达见图 2。膀胱癌细胞系 T24 敲低组招募 THP-1 细胞数，与对照组比较，差异有统计学意义（P <0.05）。253J 细胞敲低组招募 THP-1 细胞数，与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05），显示 CXCL5 敲减抑制膀胱癌细胞对THP-1 细胞招募能力。见表 1。

2.4 T HP-1 源性巨噬细胞对膀胱癌对多柔比星抵抗性的影响

膀胱癌细胞系T24 共培养组细胞存活率，与对照组比较，差异有统计学意义（P <0.05）。253J 共培养组细胞存活率，与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05），THP-1 源性巨噬细胞共培养可以增强膀胱癌细胞对多柔比星的抵抗性。见表 2。

3 讨论

肿瘤微环境是肿瘤发生、发展过程中重要机制， TAMs 在肿瘤进展中发挥重要功能，既往报道发现TAMs 在肾癌 [6]、肝癌 [7]、肺癌等 [8] 多种恶性肿瘤疾病中浸润增加，本研究发现在膀胱癌中，膀胱癌细胞招募 TAMs 能力高于正常膀胱上皮细胞，TAMs 很可能在膀胱癌恶性进展中起到关键作用。

CXCL5 是 CXC 族趋化因子成员 [9]，趋化因子主要作用是作为化学引诱物介导细胞特异性迁移，吸引相关炎症细胞的组织浸润。研究发现 CXCL5 在前列腺癌 [10]、乳腺癌 [11]、胰腺恶性肿瘤 [12] 和肾癌 [13] 中高表达，而有关 CXCL5 在膀胱癌中对 TAMs 招募作用尚未报道。本研究通过实验发现膀胱癌细胞 CXCL5 表达高于正常膀胱上皮细胞，且 CXCL5 敲减能抑制膀胱癌细胞对 THP-1 细胞招募能力，说明 CXCL5 在膀胱癌细胞对 THP-1 细胞招募过程中发挥重要功能。

TAMs 促进肿瘤的生长、侵袭和转移，同时 TAMs 高浸润增强多种恶性肿瘤如乳腺癌或胃癌患者对化疗药物耐药及引起预后不良 [14-16]，因此笔者想要探讨肿瘤相关巨噬细胞对膀胱癌细胞化疗耐药产生的影响，发现共培养后加入多柔比星相对多柔比星对照组化疗药物对膀胱癌细胞杀伤作用明显下降，说明肿瘤相关巨噬细胞可以促进膀胱癌细胞对多柔比星的化疗耐药性。

综上所述，膀胱癌细胞通过分泌过多的CXCL5招募巨噬细胞，同时招募的肿瘤相关巨噬细胞能够反向性作用于膀胱癌细胞,增强膀胱癌的化疗耐药性，对膀胱癌的治疗提供了新的思路。

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