结直肠癌中KＲAS、NＲAS 基因突变与临床病理特征的关系

结直肠癌中KＲAS、NＲAS 基因突变与临床病理特征的关系

文章发表于：《中国老年学杂志》

作者：潘理会、李育庄、李春辉（承德医学院）

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【摘要】

目的：探讨结直肠癌( CＲC) 中大鼠肉瘤病毒癌基因( KＲAS) 、大鼠肉瘤病毒转化基因( NＲAS) 基因的常见突变类型与临床病理参数的关系。

方法：从CＲC 石蜡包埋组织中提取基因组DNA，采取实时荧光定量PCＲ 法进行KＲAS、NＲAS 基因扩增，分析其突变状态与CＲC 临床病理参数的关系。

结果：检测到86 例( 36. 1%) KＲAS 基因突变，总突变率为11例( 4. 6%) NＲAS 基因突变。不同淋巴结转移及Duke 分期的组间KＲAS 突变差异有统计学意义( P＜0. 05) ，而在不同年龄、性别，肿瘤发生部位、组织学分型、分化程度、浸润深度的组间差异无统计学意义( P＞0. 05) ； NＲAS 突变在不同年龄、性别、肿瘤发生部位、组织学类型、分化程度、淋巴结转移、Duke 分期及浸润深度的组间差异均无统计学意义( P＞0. 05) ； KＲAS 与NＲAS二者之间突变无相关性。

结论：CＲC 中KＲAS 突变较高，NＲAS 突变相对较低； KＲAS 突变与CＲC 的侵袭、转移有关，二者在CＲC 的进程中可能是独立发挥着促进作用。

【关键词】结直肠癌； KＲAS 基因； NＲAS 基因； 突变；

研究报道结直肠癌( CＲC) 的发生、发展与表皮生长因子受体( EGFＲ) 介导的信号传导通路EGFＲ/大鼠肉瘤( ＲAS) /鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1( BＲAF) 的调控密切相关[1]，近年一些靶向EGFＲ的单抗药物已成功应用于CＲC 的临床治疗，取得良好疗效，但抗EGFＲ 单抗药物的有效性受其下游ＲAS 基因[包括大鼠肉瘤病毒癌基因( KＲAS) 、大鼠肉瘤病毒转化基因( NＲAS) ]类型的影响，对ＲAS 野生型携带者疗效显著，对ＲAS 突变型患者疗效不佳。目前检测KＲAS 和NＲAS 基因突变状态已成为众多专家学者研究肿瘤靶基因治疗的热点课题，本文采用实时荧光定量PCＲ 检测KＲAS、NＲAS 基因在CＲC 组织中的表达情况，并结合临床病理参数探讨二者在CＲC 发生、发展中的作用机制。

1 资料与方法

1. 1 研究对象

选取2012 年12 月至2015 年5 月间承德医学院附属医院行手术切除的CＲC 蜡块标本238 例。所选标本均有完整的临床病历及病理资料，且术前均未接受任何化疗及抗肿瘤药物治疗。

1. 2 DNA 提取

CＲC 石蜡包埋组织连续切片4 μm厚1 ～ 2 张，苏木精-伊红( HE) 染色，显镜下观察形态，标记肿瘤细胞比例达70%以上的标本。将做好标记的标本连续切片8 ～ 10 μm 厚5 ～ 6 张，常规脱蜡、水化处理，刮取肿瘤组织于EP 管内，按照试剂盒说明书步骤提取DNA，应用紫外分光光度计测定提取DNA 的质量和浓度，A260 /A280 在1. 7 ～2. 1 之间为符合标准。

1. 3 实时荧光定量PCＲ扩增

采用PCＲTaqMan探针技术检测标本中KＲAS、NＲAS 基因的突变情况，严格按照检测试剂盒说明书进行操作。反应体系包括模板50 ng、正反向引物各25 pmol、MasterMix 及TaqMan 标记探针，总反应体系各为50 μl。反应条件分3 步: 第1 步: 42℃ 5 min，95℃ 5 min，1个循环； 第2 步: 95℃ 25 s，64℃ 20 s，72℃ 20 s，15个循环； 第3 步: 93℃ 25 s，60℃ 35 s，72℃ 20 s，31个循环，第3 阶段60℃收集信号，进行实时荧光定量PCＲ。每次实验均设定突变的阴、阳性及空白对照孔。

1. 4 结果判读

以无模板对照扩增曲线的最高点为准设定阈值，没出现扩增曲线或Ct≥28. 0 的标本为阴性标本； 出现扩增曲线且Ct≤26. 0 的标本为阳性标本； 26. 0 ＜Ct ＜ 28. 0 的标本为可疑阳性，重复检测。

1. 5 试剂与仪器

石蜡组织DNA 提取试剂盒及人KＲAS、NＲAS 基因突变检测试剂盒均购自厦门艾德生物医药科技有限公司； 实时荧光定量PCＲ 仪购自杭州赫贝科技有限公司。

1. 6 统计学方法

采用SPSS11. 5 软件进行χ2 检验、Pearson 相关性分析。

2 结果

2. 1 KＲAS 基因突变情况及与临床病理特征的关系

86 例( 36. 1%) KＲAS 基因突变，随着淋巴结远处转移和Duke 分期的增高KＲAS 突变率明显增加( P＜0. 05) ，在其他临床病理特征的组间差异均无统计学意义( P＞0. 05) ，见表1。

2.2  NＲAS 基因突变情况及与临床病理特征的关系

11 例( 4. 6%) NＲAS 基因突变。NＲAS 突变率在各临床病理特征的组间差异均无统计学意义( P＞0. 05) ，见表2。

2. 3 CＲC 组织中KＲAS 与NＲA 基因突变的相关性

未检测到KＲAS 与NＲAS 同时突变者，表明二者突变相互排斥，相关分析显示，KＲAS 与NＲAS 突变没有明显相关性( r = 0. 782，P = 0. 058) 。

3 讨论

EGFＲ 是一种酪氨酸激酶受体，与配体结合后激活刺激其介导的下游信号传导通路膜受体酪氨酸蛋白激酶信号传递途径( ＲAS /ＲAF /MAPK) 发生级联反应，导致细胞异常增殖、转移，发生癌变[1]。抗EGFＲ 单抗可通过拮抗其与配体的结合，阻止其活化，进而阻断其下游信号通路的传导，从而发挥抗瘤作用。KＲAS 与NＲAS 基因是EGFＲ 通路下游调控因子ＲAS 家族的重要成员，二者中任何一种发生突变都可不通过EGFＲ 活化刺激而直接激活EGFＲ 通路引发癌变。国外文献报道在CＲC 中KＲAS 突变率为30%～55%，主要发生在2 外显子12 和13 密码子上； NＲAS 突变率为1%～ 6%，主要发生在3 外显子61 密码子上[2，3]。国内研究报道CＲC 中KＲAS突变率为43. 8%，NＲAS 突变率较低为1. 9%[4]。也有报道CＲC 中KＲAS 突变率为42. 57%，NＲAS 突变率为3. 96%[5]。本研究与国内外报道的基本相符，同时本研究数据显示KＲAS 突变率明显高于NＲAS，KＲAS 突变在CＲC 中是常见的生物学事件，可能是CＲC 发病的主要机制之一，而NＲAS 可能不是主要机制。KＲAS 的突变状态可作为临床选用抗EGFＲ 单抗药物的重要参考指标，而NＲAS 突变状态的预测价值还在探讨中。研究表明，对CＲC 患者行单一检测KＲAS 基因是不够的，还要联合检测NＲAS 基因，只有联合检测KＲAS、NＲAS 基因的CＲC 的患者才能建议使用EGFＲ 靶向药物治疗[6]，所以，肿瘤组织中NＲAS 突变率虽然偏低，其突变状态的检测是不可忽视的，联合检测KＲAS、NＲAS 基因突变状况，对筛选出适应抗EGFＲ 靶向药物治疗的患者有重要的指导价值。

目前，关于KＲAS 和NＲAS 突变状态与CＲC 中临床病理参数的关系报道无统一定论。有文献报道，CＲC 中KＲAS 突变在有淋巴结转移和TNM 分期增加的患者中明显增高[7]； CＲC 中KＲAS 突变更常见于女性和近端结肠[8]； CＲC 中NＲAS 突变在远端结直肠癌突变率较高[9]； 还有研究报道CＲC 患者KＲAS /NＲAS 突变与年龄相关，≥65 岁的老年患者突变率较高，而与性别、原发部位、组织学类型、分化程度、分期、区域淋巴结转移、术后复发转移均无关[10， 11]。吴新新等[12]对147 例CＲC 患者的KＲAS和NＲAS 基因突变情况进行检测，发现KＲAS 突变的发生更倾向于淋巴结转移及Duke 分期C 期患者，与年龄、性别、肿瘤部位、组织学类型、分化程度、远处转移、癌结节及美国癌症联合会( AJCC) 分期等均无关； NＲAS 突变与上述所有病理特征均无相关关系。代云等[13]对265 例CＲC 患者的KＲAS 和NＲAS 基因突变情况进行检测，发现二者突变与年龄相关，高龄患者突变率较高，而与性别、原发部位、组织学类型、分化程度、TNM 分期、区域淋巴结转移、远处转移、术后复发转移等临床病理特征均无关。本研究表明KＲAS 参与了CＲC 的侵袭、转移，预示患者预后不良； KＲAS 突变对高危转移患者的早期筛选和预后评估有重要参考价值，也为肿瘤的侵袭、复发机制研究提供了新的方向。上述结论各家研究，差异很大，造成这些差异的原因，可能与各家研究的样本量、检测方法及判读标准不同等因素有关，有待于进一步研究探讨。上述研究结果表明KＲAS 和NＲAS 虽同为一个家族成员，同为EGFＲ信号通路下游重要的效应因子，但在肿瘤发生、发展过程中所起的调控作用不尽相同。近年来，国内外对CＲC 中EGFＲ 信号通路上KＲAS /NＲAS 突变状态与临床病理参数关系的研究刚刚兴起，许多认识还不够成熟，尤其对NＲAS 的检测较少且检出率偏低，提示临床CＲC 患者抗EGFＲ 药物治疗时，应多基因联合检测来指导靶向药物方案的制定。明确KＲAS /NＲAS 与CＲC 病理参数的相关性，有助于阐明CＲC 发病机制，有助于CＲC 的靶基因治疗。对二者突变状态的检测还应扩大检测规模，采取多种研究手段，综合论证分析。目前，关于肿瘤中KＲAS和NＲAS 突变之间相关性的研究国内外少见报道，有资料显示，CＲC 中KＲAS 和NＲAS 之间基本不存在交叉突变[14]，二者突变相互排斥[15]。本研究与上述研究结果相一致，经相关分析显示，KＲAS 和NＲAS 之间突变没有关联，提示二者可能是彼此独立的影响着CＲC 的进程，具体机制还需进一步研究。

【参考文献】

[1] Ouerhani S，Bougatef K，Soltani I， et al．The prevalence and prognostic significance of KＲAS mutation in bladder cancer，chronic myeloid leukemiaand colorectal cancer[J]． Mol Biol Ｒep，2013； 40 ( 6 ) :4109-14.

[2]Ｒiely GJ，Ladanyi M. KＲAS mutations: an old oncogene becomes a new predictive biomarker[J]．J Mol Diagn，2008； 10( 6) : 493-5.

[3]Downward J. Targeting ＲAS signalling pathways in cancer therapy [J]．Nat Ｒev Cancer， 2003； 3( 1) : 11-22.

[4]孙新超，秦旭，王金海，等. 结直肠癌患者肿瘤组织中KＲAS、NＲAS、BＲAF 基因突变状态分析[J]． 社区医学杂志，2017； 15( 11) : 8-11.

[5]吴永芳，徐春伟，宋业颍，等. 结直肠癌患者肿瘤组织中KＲAS、NＲAS 和BＲAF 基因突变的分子病理检测分析[J]．临床与病理学杂志，2015； 35( 7) : 1385-9.

[6] Dai L，Song L，Li X， et al．Association of visit-to-visit blood pressurevari ability with the risk of all-cause mortality and cardiovascular events in general population[J]． J Clin Hypertens，2018； 20 ( 2 ) :280-8.

[7]罗妙玲，徐韫健. 结直肠癌KＲAS、BＲAF 及PIK3CA 基因突变状态分析[J]．热带医学杂志， 2016； 16( 7) : 843-6.

[8]晋龙，眭玉霞，王丽萍，等. 结直肠癌KＲAS 突变与临床病理特征的关系[J]．基础医学与临床，2018； 38( 1) : 32-6.

[9]OguraT，Kakuta M，Yatsuka T， et al．Clinicopathological characteristics and prognostic impact of colorectal cancers with NＲAS mutations[J]．Oncol Ｒep， 2014； 32( 1) : 50-6.

[10]李艳艳，高静，杨蕊，等. 结直肠癌ＲAS、BＲAF、KＲAS、PIK3CA基因突变分析与临床病理特征的关系[J]． 临床肿瘤学杂志，2016； 21( 1) : 27-33.

[11]历金雷，蔡剑辉，任约翰，等. NＲAS、BＲAF、KＲAS、PIK3CA 基因突变检测在结直肠癌治疗和预后中的临床价值研究[J]．中国现代医生， 2017； 55( 23) : 1-6.

[12]吴新新，马杰，任鹏飞，等. 结直肠癌KＲAS、NＲAS 和BＲAF 基因突变与病理特征、吸烟和饮酒之间的相关性[J]．郑州大学学报( 医学版) ，2016； 51( 1) : 39-43.

[13]代云，郑国华，李青. 结直肠癌患者BＲAF、KＲAS、NＲAS 和PIK3CA 基因突变与其病理特征的关系[J]． 临床与病理杂志，2017； 37( 5) : 875-9.

[14]刘影，郑细闰，朱亚珍，等. 252 例结直肠癌组织中KＲAS、NＲAS、BＲAF、PIK3CA 的基因突变分析[J]． 临床与实验病理学杂志，2016； 32( 8) : 851-9.

[15]祁秀敏，张熔熔，唐威，等. KＲAS、NＲAS 、BＲAF 基因突变联合检测在转移性大肠癌中的意义[J]． 广东医学，2017； 38 ( 2) :276-9．