科研 | Gut Microbes: 欧洲队列中大肠杆菌和脆弱类杆菌毒素蛋白诊断前抗体应答与结直肠癌的相关性

编译：微科盟一山，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

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所研究人群的平均年龄为59岁(标准差为8岁)，51%的参与者是女性。抽血到诊断的中位数时间为3.4年，范围在0到8.5年之间。患者往往比对照组更有可能肥胖(BMI≥30kg/m²)(分别为21%和16%)，以前或现在吸烟者(分别为59%和52%)。肠癌患者组相对于对照组有较高的每日能量摄入量(平均分别为2173 kcal和2052kcal)(表1)。

我们分别检测了对E.coli和ETBF蛋白的IgA和IgG抗体反应，并比较了持续荧光强度在病例和对照组之间的反应水平(图1)。这项分析是在血清阳性病例和对照中进行的，因为一些抗原的抗体水平大多低于检测的技术极限。病例组与对照组抗体水平差异无统计学意义(P>0.05)。因此，在这项研究中，我们决定不更详细地分析抗体反应水平，而是将重点放在血清阳性上，作为一种更可靠的衡量标准。

应用血清阳性界值(表2)将42%的对照组定义为对任何E.coli蛋白IgA阳性，相比之下，49%的病例为IgA阳性(表3)。这一差异具有统计学意义，粗略模型中大肠癌的OR值为1.37(95%CI：1.04，1.8；p值=0.024)，多变量调整模型1的OR值为1.35(95%CI：1.02，1.79，p值=0.035)，多变量调整后的模型2调整饮食变量和体力活动后的OR值为1.42(95%CI：1.05，1.91；p值=0.022)。然而，经FDR调整后的值没有保持显著性，相应的Q值分别为0.096、0.118和0.088。鉴于p值是从一种明确的假设驱动的方法中得出的，通过对两种细菌进行少量的比较，我们的解释基于观察到的p值，并将q值作为一个保守的平衡。

对任何E.coli蛋白IgG呈阳性反应(对照：64%，肠癌病例69%)或对任何BFT亚型IgA或IgG呈阳性反应(IgA：对照，5%，肠癌病例6%；IgG：对照，11%，肠癌病例14%)之间差异无统计学意义。在被评估的单个E.coli蛋白中，对照组中ClbM的抗体应答率最低(IgA：0%和IgG：3%)，Ag43的抗体应答率最高(IgA：16%和IgG：31%)。对于ETBF，两种亚型的抗体应答率相似(BFT-1：IgA，4%和IgG：6%；BFT-2：IgA：2%和IgG：9%)。E.coli Ag43蛋白IgA阳性(OR：1.55；95%CI：1.08，2.21)和ETBF毒素BFT-1IgG阳性(OR：1.80；95%CI：1.06，3.04)与大肠癌的发生有关。

我们进一步评估了对E.coli或ETBF蛋白或其组合的IgA或IgG阳性，与结肠癌主要解剖近端或远端亚部位发生癌症的几率更高相关(表4)。对任何E.coli蛋白、任何ETBF蛋白均呈IgA和IgG阳性，且对这两种蛋白均呈双重阳性的近端结肠癌比远端结肠癌更常见(表4)。此外，E.coli蛋白或ETBF蛋白的IgG阳性反应以及E.coli和ETBF的双重IgG阳性反应与发生近端结肠癌的风险显著相关(分别为OR：2.12；95%CI：1.20，3.76，OR：1.87；95%CI：1.04，3.34；OR：2.75；95%CI：1.16，6.50)，但与远端结肠癌的发生无统计学意义(OR：2.12；95%CI：1.20，3.76；OR：1.87；95%CI：1.16，6.50)。然而，异质性的p值并不表明不同站点之间存在统计学上的显著差异(分别为0.093和0.095)。

E.coli的IgA/IgG双重阳性与单独检测IgA相比，发生大肠癌的几率更高(OR：1.57；95%CI：1.07，2.32)，而两种细菌的联合阳性与单个Ig类大肠癌的发生相似(尽管不显著)。然而，这些分析的范围有限，因为对ETBF的双重肯定的数量很少(补充表S2)。

在对目前欧洲前瞻性队列中的大肠癌病例对照研究中，我们观察到，对涉及生物膜形成和大肠杆菌素分泌的E.coli蛋白以及对ETBF毒素的抗体阳性反应与发生大肠癌的几率有较高相关性。具体地说，E.coli和ETBF的IgG双重阳性反应提高1.79倍的大肠癌发病几率和2.75倍的近端结肠癌症发病几率。虽然这些发现在FDR多重检验校正后没有保持显著性，但我们认为这种校正过于严格，因为我们所有的分析都是根据我们的既定假设预先计划的，相关测试的抗原数量并不多。

据我们所知，这是第一项评估E.coli和ETBF与发生大肠癌几率之间关系的血清学研究。此前的研究主要集中在肿瘤组织或粪便样本中直接检测这些细菌。我们的发现与Dejea等人的标志性研究一致，该研究描述了CRC患者的组织种生物膜的存在由pks+E.coli和ETBF组成。在我们的研究中，关于疾病的遗传信息难以获得。然而，关于散发性大肠癌患者的研究已经证明了结肠组织中生物膜的存在，特别是在发生于近端结肠的肿瘤中。总的来说，我们研究中49%的肠癌病例对E.coli和ETBF呈IgA阳性，69%的病例对检测中所包括的七种E.coli蛋白中的任何一种都呈IgG阳性。虽然我们无法比较本研究与前人研究中对E.coli和ETBF的血清抗体应答率进行比较，但有几项研究直接在组织中检测到了这两种细菌。有在肿瘤组织中检测出pks+E.coli的研究指出，在大肠癌病例中检测出pks+E.coli的病例患病率较低，为22%至55%。然而，我们的血清学检测包括的蛋白不一定是pks+ E.coli菌株所特有的，但通常也与宿主细胞的附着、聚集和生物膜的形成有关。这运蛋白包括AIDA-I、Ag43、TIBA、I型菌毛FimA和FimH蛋白以及CsgA蛋白，CsgA蛋白是生物膜基质的主要蛋白质成分curli的一种成分。这些蛋白在不同肠癌病例中的血清抗体应答率各不相同，FIMA最低(IgA1%和IgG8%)，Ag43最高(IgA 23%和IgG 33%)。这种差异也可以由同一细胞器的不同蛋白质中引起，比如FimA和FimH作为I型菌毛的一部分，但其应答率也不同。这可能是由于重组表达的蛋白的免疫原性不同或这些蛋白被宿主免疫系统识别的程度不同所致。在我们的研究中，Ag43的IgA血清阳性是唯一与发生CRC的几率显著相关的抗原，这可能表明这种自身转运蛋白在CRC发生中的重要性。有研究指出在两个研究队列中5%的肠癌病例中，pks+E.coli可以作为肿瘤突变的特征。这种匹配的频率与蛋白ClbM(IgA：1%，IgG：5%)的血清抗体应答率一致，ClbM是一种从pks+岛表达的MATE家族外排转运蛋白，与E.coli毒素蛋白colibactin的易位有关。关于大肠癌组织中ETBF与患病率关系的研究报告的指出，检测到ETBF的病例的发病率从26%到68%不等。同样，一项分析粪便样本的研究发现，32%的大肠癌患者ETBF DNA检测呈阳性。虽然我们纳入了BFT-1和BFT-2两种异构体，以潜在地提高血清学检测的灵敏度，但观察到总体BFT应答率较低(IgA：6%，IgG：14%)。同样，在我们研究的大肠癌病例中，E.coli和ETBF的双重血清阳性率(IgA：5%，IgG：12%)低于Dejea等人的报道。我们必须考虑血清学是感染发生的间接或系统性手段。我们试图分别检测粘膜和系统的抗体反应，分别检测IgA和IgG，然而这些不一定需要来自于结直肠的感染。此外，由于我们没有血清学金标准来验证我们新开发的检测方法，我们重组表达的蛋白可能缺乏免疫原性。这在一定程度上解释了我们研究中获得的细菌血清流行率与之前报道的直接检测大肠癌患者肿瘤组织或粪便样本中的细菌种类的不同。Messaritakis等人最近的一项研究中通过检测健康捐献者和大肠癌患者的血液中直接检测细菌DNA来评估肠道上皮屏障的细菌移位。但作者没有进一步确定感染E.coli或ETBF的菌株，但在16%的健康献血员和26%的病例中发现了大肠杆菌DNA，而脆弱芽孢杆菌DNA的检出率分别为0%和55%。将这些数据与我们的血清学分析进行直接比较，将有助于更好地理解这项研究的结果。

在我们的研究中，IgA和IgG阳性与结直肠癌相关的OR值是相似的，尽管对于E.coli和ETBF双重阳性检测只对IgG的测定有统计学意义。这一观察结果可能仅仅是由于IgG抗体的血清流行率较高，或者是双重阳性的受试者的低流行率所致。总体而言，对所有包含的蛋白的定量IgA抗体应答均低于相应的IgG抗体应答。然而，我们也不知道与肿瘤发生相关的感染时间，以及对这两种细菌的抗体反应时长。然而，目前尚不清楚这些微生物在癌变之前可能在多大程度上感染健康的结肠组织，或者它们是否只感染正在发育的肿瘤，这是因为细菌易位只穿过受损的肠道屏障。在这两种情况下，细菌都可能诱导IgA类的粘膜抗体反应或IgG类的系统抗体反应，并可能产生致癌作用。由于在我们的研究中，我们既没有能力估计血清转换的时间点，也缺乏抽血时是否存在癌前病变的信息，所以我们的数据没有提供这些问题的答案。文献中的一个说明性例子描述了细菌驾驶员-乘客模型。在这方面，观察到的溶血性链球菌与结直肠癌发生的关联被认为是由于肿瘤形成导致结肠上皮屏障受损后引起局部和全身感染的“客菌”效应所致。E.coli和ETBF在结肠组织中的感染和生物膜形成的机制、由此产生的宿主免疫反应以及这两种细菌的潜在致癌特性可能是大肠癌发生的早期事件。然而，这一假说值得进一步研究，以更好地理解大肠癌发病过程中致病序列的潜在含义。

我们的研究有几个明显的局限性和优势。首先，多重血清学检测的蛋白质选择不是一种绝对正确的方法，而是集中在以前发表的关于潜在相关蛋白质功能的文献上。因此，在我们的研究之前，人们对这些蛋白的免疫原性知之甚少。据我们所知，目前还没有血清学金标准检测方法可供验证，我们使用这种新方法的结果需要在独立研究中得到证实。与肿瘤组织化验相比，使用血清学分析的一个主要优点是，大多数队列存储了他们研究参与者的血液样本，从而可以对与癌症风险的关联进行前瞻性分析。此外，所应用的多重血清学允许对多个抗原以及不同Ig类的大量样本进行高通量分析。这使我们能够直接比较宿主对多个细菌物种的抗体反应，并评估了更详细的对细菌的免疫反应，而不仅仅是总的血清阳性率。然而，由于对众多抗原和免疫球蛋白类别进行了评估，人们也可能会认为我们的研究结果需要对多重比较进行修正。我们承认，多重检测的比较修正可能使我们的结果失去意义。因此，需要有更大规模的研究来证实我们的发现。一般来说，多重血清学的另一个优势是能够量化抗体反应的水平。由于某些抗原的免疫反应低于技术极限，我们仅在血清阳性者中比较了定量抗体水平，没有发现任何抗体水平在病例和对照之间有统计学差异的抗原。取而代之的是，我们将重点放在血清阳性上，将其作为大肠癌相关性的更有力的衡量标准。另一个限制是，我们没有必要的数据来评估E.coli和ETBF血清阳性与肿瘤分子分型的关系(例如MSI或APC和KRAS突变状态)。最后，尽管对相关协变量进行了控制，但不能完全排除残留混杂。然而，这项研究设计的一个主要优点是，它基于覆盖西欧大部分地区的大型多中心队列，包括了详细的前瞻性数据收集和诊断前几年采集的血清样本。

总之，这项嵌套在EPIC内的病例对照研究，E.coli蛋白和ETBF毒素的抗体反应与发生大肠癌的几率较高相关，且其主要发生在肿瘤近端。这项新开发的E.coli和ETBF多重血清学试验的首次应用需要在其他环境中进行验证，以评估这两种细菌的存在是否会增加发生结直肠癌的风险。