微生物代谢物脱氧胆酸促进肠癌变中血管生成拟态的形成

发表时间：2021.11.23

通讯作者：曹海龙；Weilong Zhong；孙涛

通讯作者单位：天津医科大学；南开大学

DOI号：10.1111/cas.15208

实验设计

实验设计图 表1. 按饮食类别选择的结直肠癌患者的基线特征。 

表2. 用于实时PCR的引物序列。

结果

1 高脂饮食加剧了结直肠癌患者的血管生成拟态形成和上皮-间充质转化过程

越来越多的证据支持VM与HFD密切相关。一项队列研究表明，有肝转移的大肠癌患者血清低密度脂蛋白水平显著高于无肝转移的大肠癌患者。此外，HFD可增加小鼠结肠癌的血管生成和转移。为了了解HFD与大肠癌进展之间的关系，我们研究了HFD对大肠癌患者VM和EMT的影响。我们发现患有HFD的CRC患者的VM通道阳性数明显高于患有ND的CRC患者（图1A）。

此外，免疫组织化学显示HFD降低了E-钙粘蛋白的表达水平，并提高了波形蛋白的表达（图1B，C），波形蛋白分别作为上皮标记物和间充质标记物。这些结果表明HFD可能与大肠癌的EMT过程和VM形成密切相关。

图1. 高脂肪饮食加剧了结直肠癌患者血管生成拟态的形成。A. CD34/PAS双重染色用于识别血管生成拟态（VM）和内皮依赖性血管。黄色箭头指向VM+通道（PAS正极和CD34负极通道）。标尺：50 μm。B和C，免疫组织化学染色用于区分ND和HFD组之间的EMT相关标记物（E-钙粘蛋白和波形蛋白）。比例尺：100 μm。*P<0.01，***P<0.001。每组n=30。

2 高脂饮食改变了Apcmin/+小鼠肠道微生物群的组成和粪便胆汁酸谱

众所周知，HFD可诱导小鼠肠道微生物群失调。为了确定ND组和HFD组肠道微生物组的变化，我们使用基于16S rRNA的高通量测序技术来确定小鼠粪便微生物组的组成。使用维恩图确定不同组的唯一和共享OTU（图2A）。HFD组有276个OTU，ND组有307个OTU，共有222个OTU。当使用主成分分析（PCA）分析两组之间的差异时，各组的肠道微生物群组成显示出明显的聚集性，并不相似（图2B）。

在门水平上，两组之间的微生物群落组成不同。在HFD组中，厚壁菌和放线菌的相对丰度随着拟杆菌的减少而升高，并且厚壁菌/拟杆菌的比率同时增加（图2C）。然后，我们使用Chao指数揭示HFD喂养的小鼠与ND喂养的小鼠相比细菌丰富度较低（图2D）。相似性分析（ANOSIM）和代表β多样性的热图显示两组之间存在显著差异（图2E，F）。接下来，使用LEfSe分析来估计ND组和HFD组之间的差异丰富物种。患有HFD的小鼠有较高水平的机会性病原体，包括肠球菌、链球菌、Lachnoclostridium、Alistipes和Desulfovibrio。相反，与ND组相比，HFD组的有益细菌，如Candidatus Arthromitus、Marvinbryantia和Parasutterella相对较少（图2G）。

为了研究HFD干预引起的粪便BAs的动态变化，采用液相色谱-质谱法对粪便中的BAs进行定量分析。如图2H所示，HFD导致Apcmin/+小鼠的初级BAs不成比例增加，次级BAs明显增加。尤其是HFD组的粪便DCA水平增加了600倍以上。我们通过Spearman相关分析进一步探讨了BA谱与肠道微生物群组成之间的关系（图2I）。有趣的是，Mucispirillum、Blautia、乳酸杆菌、副杆菌、肠球菌、大肠杆菌和链球菌与继发性BAs（如DCA、wMCA、HDCA、LCA、TDCA、6-酮LCA和NorDCA）呈正相关，而与原发性BAs（如TUDCA、CDCA、CA、TaMCA和TbMCA）呈负相关。更重要的是，这些微生物属具有形成胆盐水解酶（BSH）的共同功能，该酶催化共轭初级BAs的水解。大多数这些微生物在HFD组更为丰富。

总之，这些数据表明HFD在调节肠道微生物群和干扰BA代谢方面具有重要意义。尤其是DCA是BA谱中最明显的变化，这可能对HFD诱导的CRC的发生和发展有重要影响。

图2. 高脂饮食改变了Apcmin/+小鼠肠道微生物群的组成和粪便胆汁酸谱。A. 维恩图。B.  两组粪便细菌的主成分分析（PCA）。C. 两组在门水平上微生物群落组成的差异。D. Chao指数。E. 基于加权UniFrac距离的方差分析。F. 热图显示出明显的差异。G. 通过效应大小线性判别分析（LEfSe）生成的分支图中差异丰富的物种。H. 检测用ND或HFD治疗的Apcmin/+小鼠的粪便胆汁酸（BAs）水平，表明HFD中的脱氧胆酸（DCA）显著升高。I. 几种显著变化的粪便BAs与细菌属之间的Spearman相关分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。ND，n=5；HFD，n=8。

3 高脂饮食诱导的微生物代谢产物脱氧胆酸加速Apcmin/+小鼠的癌变

进行了进一步的研究，以确定单独使用DCA是否足以诱发HFD的类似效应（图3A）。DCA治疗后小鼠的生活状态没有差异，没有一只小鼠死亡。在食物摄入量没有差异的情况下，两组的体重都逐渐增加，但没有发现差异（P>0.05，图3A）。DCA组小肠和结肠的平均肿瘤数量分别增加约1.6倍（11.10±0.90 vs 18.30±1.21，P<0.001）和2.6倍（0.70±0.26 vs 1.80±0.29，P<0.05）（图3B）。

同时，与对照组相比，DCA组小肠各节段的肿瘤数量显著增加（图3C）。

此外，DCA组各种大小的肿瘤数量增加，主要是直径为1-2 mm和>2 mm的肿瘤（1-2 mm:4.80±0.61 vs 8.00±0.77，P<0.01；>2 mm:1.10±0.31 vs 3.80±0.63，P<0.01，图3D）。更重要的是，形态学显示对照组仅观察到少量散在的小息肉，而DCA组观察到较大的肿瘤，尤其是结肠肿瘤（图3E）。组织病理学上，在DCA治疗的小鼠中，70%（7/10）被证实患有高度发育不良（HGD）或粘膜内癌，而对照组中只有20%（2/10）被认为患有HGD或粘膜内癌，另有40%（4/10）被发现患有低度发育不良（LGD；图3F）。

总之，这些结果表明DCA可以促进肠道癌变。

 图3. 脱氧胆酸加速Apcmin/+小鼠的肠腺瘤-腺癌序列。A. Apcmin/+小鼠饮用无菌水或含有0.2%DCA的无菌水12周的实验流程图。DCA组和对照组之间的体重没有显著差异。B. DCA组每只小鼠的肠道肿瘤总数增加。C 和D. 在DCA组中，近端、中部和远端小肠肿瘤的数量和大小显著增加。E. 两组的小肠和结肠均显示有代表性的肿瘤宏观图像。F. 他喜欢染色*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。每组n=10。

4 脱氧胆酸诱导Apcmin/+小鼠肠上皮细胞增殖和抑制凋亡

为了更好地了解DCA对肿瘤进展的影响，我们进一步检测了肠道肿瘤组织中的增殖和凋亡。DCA组Ki-67阳性细胞的百分比显著增加（28.12%±2.57% vs 51.9%±3.60%，P<0.001，图4A）。同时，与对照组相比，通过TUNEL检测，DCA组的凋亡细胞数量减少（15.90%±1.62% vs 9.20%±1.26%，P<0.01，图4B）。DCA组的β-连环蛋白状态也显著增加，表明DCA可促进肿瘤细胞增殖（图4C）。这些发现支持DCA促进增殖，减少细胞凋亡，并加速肠腺瘤向腺癌的转变。

图4. 脱氧胆酸促进Apcmin/+小鼠肠道肿瘤细胞增殖并减少其凋亡。A和B. 从每个切片中随机选择肿瘤组织，通过Ki-67和TUNEL染色计算阳性细胞的百分比。（C）免疫组织化学染色检测β-catenin在肠道肿瘤中的表达。比例尺：50 μm。*P<0.01，***P<0.001。每组n=10。

5 脱氧胆酸驱动Apcmin/+小鼠的血管生成拟态形成和上皮-间充质转化过程

在确认DCA可促进Apcmin/+小鼠肠道肿瘤的恶性进展后，我们研究了DCA与VM形成之间的关系，VM形成与肠道肿瘤进展密切相关。与对照组相比，DCA组有更多的VM通道，这些通道由肿瘤细胞而不是内皮细胞排列（图5A）。VE钙粘蛋白是一种跨膜蛋白，负责细胞间粘附，与VM的形成呈正相关。DCA处理在mRNA和蛋白质水平上增加了VE钙粘蛋白（图5B-D）。

与对照组相比，DCA显著抑制上皮标记物（claudin-4和E-cadherin）的表达，并增加间充质标记物（波形蛋白和纤维连接蛋白；图6A，B）的表达。EMT相关蛋白的表达，包括E-钙粘蛋白和波形蛋白，也使用western blot分析进行检测，结果与实时PCR相似（图6C，D）。如图6E所示，免疫组织化学染色显示DCA降低了E-钙粘蛋白的表达，增加了波形蛋白的表达，与上述分析一致。总的来说，这些结果表明DCA可以促进Apcmin/+小鼠的VM形成并诱导EMT。

图5. 脱氧胆酸（DCA）驱动Apcmin/+小鼠的血管生成拟态形成。A. DCA组每个肿瘤组织的VM+通道数量显著增加。n=10。B. 实时MPCR评估血管生成拟态（VM）相关标记物（血管内皮钙粘蛋白[VE钙粘蛋白]）的相对mRNA水平。n=5。C和D. VE钙粘蛋白的western blot分析显示DCA组的蛋白水平较高。n=4。标尺：50 μm。*P<0.05，**P<0.01。

图6. 脱氧胆酸（DCA）诱导Apcmin/+小鼠上皮-间质转化。A和B. 实时PCR分析显示DCA分别下调上皮标记物（claudin-4和E-cadherin）和上调间充质标记物（波形蛋白和纤维连接蛋白）的表达。C和D. 波形蛋白在DCA组的表达高于对照组，而E-钙粘蛋白的表达降低。n=4。E. 免疫组化分析；每组n=10。比例尺：50 μm。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

6 脱氧胆酸加速HCT-116细胞的上皮-间质转化过程、血管生成拟态形成和迁移

以一定的时间梯度（0、24、48、72和96 h）用不同浓度（0、20、50、100和200 μM）的DCA处理HCT-116细胞。CCK-8分析显示，低浓度的DCA（<50μM）促进细胞增殖，但过高浓度的DCA可能由于毒性作用导致大量细胞坏死（图7A）。DCA以浓度依赖和时间依赖的方式在HCT-116细胞中诱导EMT。特别是，用20 μM DCA处理HCT-116细胞24 h后，波形蛋白表达显著升高，E-钙粘蛋白表达水平显著降低（图7B，C）。然后我们从mRNA水平分析实验结果，与western blot分析一致（图7D）。利用体外建立的三维模型研究了DCA对HCT-116细胞VM形成的影响。我们发现，与对照组相比，经20 μM DCA处理的HCT-116细胞形成了更典型和完整的血管样管（图7E）。此外，伤口愈合实验证实，经20 μM DCA处理的HCT-116细胞具有较高的迁移率和较窄的伤口面积，表明DCA促进了细胞迁移（图7F）。

总之，DCA加速了HCT-116细胞的EMT过程、VM形成和迁移，从而使肿瘤细胞具有更多的侵袭性和表型。

图7. 脱氧胆酸（DCA）加速HCT-116细胞的血管生成拟态形成、上皮-间充质转化和迁移。A. 用细胞计数试剂盒8（CCK-8）测定不同浓度和时间DCA处理HCT-116细胞的增殖能力。B和C. 在用DCA处理的HCT-116细胞中检测波形蛋白和E-钙粘蛋白的表达水平，以及浓度和时间变化。D. DCA处理的HCT-116细胞中上皮-间充质转化（EMT）标记物的mRNA水平。E. 介绍了三维培养模型中血管样管状结构的图像。在倒置显微镜下计数相应的图案化网络的数量。F. 伤口愈合实验表明DCA加速了HCT-116细胞的迁移。对两组伤口闭合的定量测量结果进行分析。比例尺：100 μm。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。   

7 脱氧胆酸激活Apcmin/+小鼠的血管内皮生长因子受体2信号通路

血管内皮生长因子受体2在许多癌症中过度表达，并参与转移和复发。我们发现与对照组相比，DCA组VEGFR2的mRNA水平显著升高；然而，未观察到VEGFR1水平的显著变化（图8A）。考虑到EMT相关转录因子在EMT中的作用，我们还测量了肠道肿瘤组织中的ZEB1和ZEB2 mRNA水平，DCA处理的小鼠的水平显著高于对照组（图8A）。使用western blot分析，我们研究了VEGFR2的表达及其磷酸化指数，发现VEGFR2和p-VEGFR2在DCA组中过度表达（图8B）。

免疫组织化学染色显示，与对照组小鼠相比，DCA处理的小鼠在肠道肿瘤中表现出较高的p-VEGFR2表达（图8C）。

 图8. 脱氧胆酸（DCA）激活Apcmin/+小鼠的血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）信号通路。A. 在Apcmin/+小鼠中检测VEGFR1、VEGFR2、ZEB1和ZEB2的mRNA表达水平。n=4-6。B. western blot分析检测肠肿瘤组织中磷酸化VEGFR2和总VEGFR2的表达水平。n=4。C. 通过免疫组织化学染色评估p-VEGFR2在肠道肿瘤中的表达，n=10。标尺：50μm。*P<0.05，**P<0.01。

  8 血管内皮生长因子受体2的沉默影响脱氧胆酸诱导的HCT-116细胞上皮-间充质转化过程、血管生成拟态形成和迁移

将血管内皮生长因子受体2 siRNA转染HCT-116细胞，以对照siRNA作为对照，探讨VEGFR2是否是DCA诱导的EMT和VM所必需的。通过westernblot分析确定转染效率（图9A）。由于VEGFR2转染，DCA处理的HCT-116细胞中ZEB2 mRNA表达升高受到抑制（图9B）。VEGFR2的缺失降低了DCA引起的E-钙粘蛋白的表达并提高了波形蛋白的表达水平，突出了VEGFR2在DCA诱导的EMT过程中的关键作用（图9C，D）。此外，如图9E所示，VEGFR2基因敲除降低了DCA在基质HCT-116细胞中诱导的VM形成。同样，与对照siRNA组相比，经DCA处理的HCT-116细胞的迁移能力因VEGFR2下调而减弱（图9F）。简言之，这些发现表明VEGFR2对DCA诱导的EMT和VM形成至关重要。

图9. 血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）沉默减弱脱氧胆酸诱导的HCT-116细胞血管生成拟态形成。A.  western blot检测VEGFR2 siRNA和对照siRNA的转染效果。B. 不同治疗组的上皮-间充质转化（EMT）相关转录因子（ZEB2）的mRNA水平。C和D. 在DMSO或20μM DCA条件下，评估经VEGFR2 siRNA或cntrol siRNA处理的HCT-116细胞中EMT相关标记物（E-钙粘蛋白和波形蛋白）的mRNA或蛋白质表达。E. 检测VEGFR2沉默后HCT-116细胞典型血管样管的形成能力。在倒置显微镜下显示每张图像中已完成的试管数量。F. VEGFR2基因敲除HCT-116细胞的伤口愈合试验。显示了伤口闭合的定量测量。比例尺：100 μm。*P<0.05，***P<0.001。

讨论

先前的研究表明，VM是指侵袭性肿瘤细胞形成新生血管网络，为快速生长的肿瘤提供潜在的灌注途径，并增加临床预后不良的风险。因此，可以进行进一步的研究，以探索影响VM形成的潜在致癌危险因素和相关机制。在本研究中，我们发现HFD显著促进结直肠癌患者VM的形成和EMT，提示饮食、VM和结直肠癌之间存在联系。

研究表明HFD通过肠道微生物群失调和微生物群相关代谢物的改变促进结直肠肿瘤的发生。与此一致，我们发现HFD喂养的Apcmin/+小鼠表现出独特的肠道微生物群组成和多样性，这改变了胃肠道微生物衍生代谢物的产生。BAs是一类代表肠道微生物群与宿主共代谢的代谢物。长期食用HFD会导致BA代谢异常。正如我们的研究所表明的，BASHFD导致了不成比例的变化。Apcmin/+小鼠粪便DCA明显增加。因此，HFD引起的粪便DCA水平升高可能与肠道肿瘤的进展有关。

与血管生成不同，VM是一种非内皮依赖性通道样结构，内衬肿瘤细胞。过去，VM主要在高度侵袭性恶性肿瘤中报道，如黑色素瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌和乳腺癌。最近，大肠癌中VM的形成在文献中受到了更多的关注。传统抗血管生成疗法在患者生存率和疗效方面没有充分满足临床期望，部分原因是固有的和获得性的治疗耐药性。更重要的是，肿瘤巧妙地部署了交替流动模式（VM），抗血管生成治疗产生的缺氧微环境可能进一步加速VM的形成。基于该模型，VM可能成为肿瘤临床治疗的新靶点。例如，galunisertib是一种选择性TGF-β受体激酶抑制剂，可以有效抑制VM的形成。据报道，48种R8修饰的表阿霉素双氢青蒿素脂质体可有效抑制肿瘤的VM。显然，微生物代谢物DCA在体外和体内是否能独立促进肠癌变过程中VM的形成值得进一步研究。我们的研究首次直接证明了微生物代谢物DCA对肠癌变形成VM的影响。VM为肿瘤的临床治疗提供了新的视角。

由于DCA是促进肠道肿瘤VM形成的重要危险因素，因此有必要研究这种强烈刺激效应的具体分子机制。促进VM形成的机制非常复杂，其中EMT是研究最多的。EMT是一个动态去分化过程，上皮细胞失去其典型的上皮特征，如顶端-基底极性和细胞粘附，通过下调上皮基因和上调间充质基因获得间充质细胞特征，如运动性和侵袭性。EMT参与生物学过程，如成人的胚胎发育、器官形成和组织再生，由于其在癌症发展中的潜在作用，在过去二十年中受到了更多的关注。有趣的是，我们证明单独使用HFD或DCA可导致上皮标记物的减少和间充质标记物的增加。EMT抑制剂（SB431542和U0126EtOH）明显削弱了HCT-116和HCT-8细胞的VM形成能力，表明EMT过程对肠肿瘤VM的形成至关重要。因此，我们推测DCA通过促进EMT过程对VM的形成有积极的影响。与推测一致，我们证实DCA通过上调EMT相关蛋白的表达导致VM的形成。

脱氧胆酸似乎是血管内皮生长因子（VEGF）表达的强烈刺激物，这被证明是参与肿瘤转移和血管生成的重要促血管生成因子。一项研究表明，VEGF的异常分泌与受体酪氨酸激酶结合，诱导受体二聚化和磷酸化，尤其是VEGFR1/2，导致内皮细胞再生、血管生成和肿瘤EMT的诱导。目前的研究主要集中在VEGFR2信号转导与肿瘤血管生成之间的关系，而VEGFR2在VM形成中的重要作用被忽略。在本研究中，我们证明VEGFR2参与了DCA诱导的VM形成过程，为VM治疗提供了重要靶点。索拉非尼是一种重要的抗VEGFR2药物，已被证实对犬乳腺肿瘤的VM有抑制作用。然而，短期抗VEGF贝伐单抗治疗可能通过诱导缺氧肿瘤微环境促进VM的形成，这可能在肿瘤侵袭和转移中起关键作用。因此，VEGFR2信号通路的抑制剂有可能用于新的靶向药物，以在最小化肿瘤微环境的负面影响和严格控制用药时间的情况下阻断肠肿瘤VM的形成。

总之，我们的结果表明HFD导致VM形成和肠道微生物群和BA代谢失调；DCA升高，促进了肠道肿瘤的发生和发展。更重要的是，DCA通过调制VEGFR2信号驱动EMT和VM形成（图10）。总的来说，VM的形成为DCA复杂的致癌机制提供了新的理解，并且是个体化CRC治疗的潜在治疗靶点。然而，我们主要探讨DCA在动物和细胞水平促进大肠癌的机制。至于临床水平，关于血清DCA水平与人类CRC风险之间的关联存在相互矛盾的数据，并且没有明确的结论。

由于人类和小鼠在基因、生理结构、生化环境和肠道微生物群方面存在巨大差异，小鼠模型实验的结果不足以解释人类肠道菌群。

此外，由于样本量小，研究方向受到限制。因此，微生物代谢物DCA在人类肠癌发生过程中促进血管生成拟态的形成有待进一步研究。

图10. 微生物代谢物脱氧胆酸通过激活血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）信号，促进肠癌发生的血管生成拟态形成。该示意图模型显示了微生物代谢物DCA在诱导肠上皮肿瘤细胞血管生成拟态（VM）和上皮-间充质转化（EMT）方面的作用。暴露于微生物代谢物DCA导致VEGFR2激活，从而导致上皮-间充质转化（EMT）相关转录因子（ZEB1和ZEB2）表达增加，从而诱导EMT和VM形成以促进肠癌变。