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科研 | ISME Journal：人体肠道菌群产生的丙酸盐通过上调HECTD2从而靶向促进结肠癌中EHMT2蛋白酶体的降解导读 人体微生物组是定植于人体肠道的，在人体免疫系统、食物消化和防止有害细菌方面起着至关重要的作用。据最近的研究报道人体微生物组会影响结直肠癌（CRC）的治疗，但微生物和CRC之间的作用模式仍不清楚。该研究表明，丙酸盐通过上调HECT结构域E3泛素蛋白连接酶2（HECTD2）从而促进常染色质组蛋白-赖氨酸 N-甲基转移酶 2（EHMT2）的蛋白酶体降解，进而抑制了CRC的生长。此外，EHMT2下调降低了肿瘤坏死因子α诱导蛋白1（TNFAIP1）启动子区域的H3K9me2水平，其中TNFAIP1可以作为EHMT2的新型靶标。随后，TNFAIP1的上调可以诱导CRC细胞凋亡。研究者使用Bacteroides thetaiotaomicron的培养基，发现HECTD2和TNFAIP1的上调可以降低EHMT2的水平。最后，在3D球体培养模型中研究中观察到丙酸盐和EHMT2抑制剂（BIX01294）有协同抗肿瘤作用。因此，本研究发现了以下三点：丙酸盐的抗肿瘤作用，EHMT2可以作为结肠癌治疗靶点，并且EHMT2的抑制剂和微生物在CRC中可能有协调治疗作用。 论文ID 原名：Human gut-microbiome-derived propionate coordinates proteasomal degradation via HECTD2 upregulation to target EHMT2 in colorectal cancer 译名：人体肠道菌群产生的丙酸盐通过上调HECTD2从而靶向促进结肠癌中EHMT2蛋白酶体的降解 期刊：ISME JOURNAL IF：10.302 发表时间：2022.1.1 通讯作者：Doo-Sang Park, Dae-Soo Kim, Mi-Young Son, Hyun-Soo Cho 通讯作者单位：韩国生命工学研究院，韩国科学技术联合大学院大学 DOI号：10.1038/s41396-021-01119-1 实验设计
结果 1 丙酸盐诱导人结肠癌细胞HCT116和LS174凋亡 为了检测丙酸盐在结肠癌中的抗肿瘤作用，首先发现了丙酸钠（SP）在人结肠癌细胞HCT116和LS174T中的IC50分别是2.986mM和11.67mM（附图S1）。因此选择了2.5mM和5mM的SP分别给予HCT16和LS174T，研究其在结肠癌细胞中诱导凋亡的作用机制。结晶紫染色（CV）和CCK8实验表明：相比阴性对照组，SP可以显著抑制结肠癌细胞生长（图1A和B）。此外，蛋白质印迹（WB）实验表明，SP处理的HCT116和LS174T细胞中剪切后的 PARP水平增加（图1C）。荧光激活细胞分选（FACS）实验揭示了SP处理后CRC细胞系中半胱天冬酶3/7活性的增加（图1D）与早期和晚期凋亡的活性一致（图1E）。SP处理的HCT116细胞进行RNA测序（RNA-seq）分析，发现了398个上调基因和474个下调基因（超过两倍）。使用了Cytoscape中的CluGO插件对DEGs进行GO分析（生物过程），发现SP处理与细胞生长的GO条目“生物过程的负调控”和“细胞死亡的上调”有关（附图S2）。DAVID分析发现在“生长的负调控”，“细胞凋亡的正调控”，“细胞黏附”和“炎症反应”的通路上面有富集（图1F）。KEGG通路分析发现SP 处理会影响肿瘤的细胞凋亡，TNF信号通路和转录失调（图1G）。GSEA分析发现相比对照组SP处理后调控了细胞凋亡（图1H）。 为了评估丙酸盐在正常肠道中的毒性，使用了人多能干细胞（hPSC）衍生的肠道类器官（hIO），并以剂量依赖性的方式给与丙酸盐（0 mM，1mM，2.5 mM，5 mM）并检测细胞活力。hPSC衍生的肠道类器官可以很好地模拟人类肠道的环境和复杂结构，很可能成为药理和毒理学中疾病模拟和药物筛选的成功模型。给予不同浓度的SP不影响肠道类器官的活力（图1I，J和附图S3）。因此，通过hIO实验，研究者认为丙酸盐的起效浓度有效地抑制了结肠癌细胞系的活力，而不影响正常肠道的活力。 图1 丙酸盐通过细胞凋亡抑制HCT116和LS174T的细胞生长。A，B 丙酸钠给予48 h后的细胞生长实验。HCT116和LS174T细胞在100%甲醇中固定并用结晶紫溶液染色。比例尺是200 μm（A）。细胞在37°C下孵育5 min后加入CCK-8工作液。细胞生长强度用酶标仪在吸光度450nm处检测。三个独立实验的结果取Mean ± SD。p 值是使用学生t检验（***p < 0.001）统计的（B）。C 给予丙酸钠后使用PARP抗体处理的蛋白质印迹分析。ACTB被用作HCT116和LS174T细胞的内参。使用ImageJ软件对信号强度进行量化分析。D 丙酸钠处理后，使用Muse Caspase 3/7工作溶液进行FACS分析。右上方的表示凋亡细胞和死细胞的比例（左图）。右边的柱状图展示了半胱天冬酶3/7活性的定量。三个独立实验的结果取平均±标准差（Mean ± SD）。 p值是使用学生t检验（***p < 0.001，**p < 0.01）统计。E 丙酸钠处理后对膜联蛋白 V 染色进行 FACS 分析。右下和右上象限提示早期和晚期的细胞凋亡（左图）。右边的柱状图展示了细胞凋亡的定量。三个独立实验的结果取Mean ± SD。p值是使用学生t检验（***p < 0.001，**p < 0.01）计算得出的。F DAVID的GO分析了RNA-seq中872个上调或下调基因。G 对872个基因进行DAVID的KEGG通路分析。富集通路如图所示。H 对872个基因进行GSEA分析。I 不同浓度的丙酸盐处理后hIO的形态学的代表性图像。比例尺是500 μm。J 通过CCK测定不同浓度的丙酸盐处理后的hIO中的细胞活力。每组 3 个。三个独立实验的Mean ± SD。p值使用学生t检验计算（n.s. 表示不显著）。 2 EHMT2是丙酸盐诱导的结肠癌细胞凋亡的靶点 为了验证SP治疗诱导细胞凋亡的影响，研究者研究组蛋白 - 赖氨酸甲基转移酶（HMT）和去甲基化酶（HDLs），因为已有文献报道一些HMTs和HDLs在结肠癌中过表达，且敲降HMTs和HDLs可以通过诱导CRC细胞凋亡从而抑制CRC增殖。在计算表观遗传学中，从CGA数据库（https://tcga-data.nci.nih.gov/）中选择了HMTs和HDLs过表达的（1.5倍，结肠癌/正常）521例结肠癌病人和51例正常对照。EHMT2作为SP诱导的CRC细胞凋亡的效应基因（图2A，附图S4）。在CRC组织的组织化学分析中，相比正常组织，EHMT2的表达水平在CRC组织中增加（图2B）。EHMT2是一种参与H3K9二甲基化，在转录基因调控中形成异染色质的HMT。此外，文献已报道在乳腺癌、膀胱癌和肺癌中，EHMT2的敲降参与了细胞凋亡和迁移/侵袭。SP处理CRC细胞系后，在转录水平上EHMT2没有改变；然而，蛋白印记实验（WB）中，EHMT2的蛋白表达显著降低（图2C，D）。SP处理后的免疫细胞化学（ICC）中，与对照细胞相比，SP处理的细胞中EHMT2的强度显著降低（图2E）。因此，研究者假设SP可能参与了转录修饰和蛋白酶体降解。接下来，为了验证SP是否诱导EHMT2的蛋白酶体降解，研究者在HCT116和LS174T细胞中用SP和MG132（一种蛋白酶体降解抑制剂）共同处理后进行了WB。共同处理组中，与对照相比SP处理后降低的EHMT2的水平被MG132恢复了，表明SP诱导了EHMT2的蛋白酶体降解（图2F）。此外，在用CHX，一种蛋白质合成抑制剂处理后，与对照相比，SP诱导的蛋白质降解在CRC细胞系中增加（图2G）。最后，为了评估SP处理后的EHMT2多泛素化状态，研究者用FLAG标记的EHMT2和HA标记的泛素共转染到用SP和/或MG132处理的HCT116细胞中，并使用抗FLAG抗体进行免疫沉淀实验。与对照组相比，SP和MG132处理组的EHMT2多泛素化显著增加（图2H）。因此，SP通过调节蛋白酶体降解的翻译后修饰来影响EHMT2的稳定性；进而抑制CRC细胞系的细胞增殖并诱导凋亡。该研究是首次描述丙酸盐与转录后修饰之间关系。
3 SP 诱导 HECTD2 的表达从而降解 EHMT2 为了研究SP处理后EHMT2的降解机制，研究者重新分析了RNA测序数据（选择49个E3泛素连接酶），发现了与对照处理相比，7个E3连接酶（HECTD2，HECTD3，HERC1，HERC6，NEURL1B和RNF128）上调（图3A）。为了验证蛋白酶体降解与E3连接酶的关系，研究者使用siRNA和SP处理后，观察到敲降HECTD2有助于恢复SP处理诱导的EHMT2降解（附图S5）。qRT-PCR和WB再次确认了SP处理可以上调HECTD2的表达（图3B）。已有报道：短链脂肪酸，例如丁酸和丙酸，可以抑制肿瘤细胞的HDAC活性。因此，在HCT116细胞中用SP处理后进行了WB。与对照组相比，SP处理提高了H3K27的乙酰化状态；而H3K9的乙酰化状态没有显著改变（图3C）。因此选择H3K27乙酰化来评估SP处理后HECTD2的表达。接下来，在SP处理后的HCT116细胞中使用组蛋白H3K27乙酰化抗体进行ChIP实验，发现了HECTD2启动子区域H3K27乙酰化状态的增加（图3D）。研究结果表明，微生物组产生的丙酸盐抑制HDAC的活性，从而上调了结肠癌中HECTD2的表达。 HECTD2是一种E3连接酶，是从E2泛素偶联酶转移泛素的底物。在HECTD2的siRNA实验中，敲降HECTD2可以抑制SP对EHMT2的降解（图3E）。CHX处理后，相比对照siRNA，siHECTD2处理降低了SP处理后EHMT2的降解速率（图3F）。此外，研究者还检测到siHECTD2和SP处理组中多泛素化状态的降低（图3G）。半胱天冬酶3/7的FACS实验发现，与单独SP处理组相比，siHECTD2和SP共处理降低了半胱天冬酶3/7活性（图3H）。因此，SP可能诱导HECTD2的表达促进了EHMT2的蛋白酶体降解；同时EHMT2的降低诱导了细胞凋亡从而抑制了结肠癌的生长。 图3 SP处理诱导HECTD2表达从而降解EHMT2。A 对照和SP处理后RNA-seq数据（E3泛素连接酶）的热图。B SP处理后HECTD2的qRT-PCR分析。三个独立实验的Mean ± SD。p值是使用学生t检验（**p < 0.01，***p < 0.001）统计（上方的柱状图）。使用抗HECTD2处理给予丙酸钠后的蛋白质印迹分析。ACTB被用作HCT116细胞的内参（下方）。使用ImageJ软件对信号强度进行量化。C 在HCT116细胞中用SP处理24h后组蛋白H3K27乙酰化（左）和H3K9乙酰化（右）的蛋白质印迹分析。组蛋白H3用作内参。使用ImageJ软件对信号强度进行量化。D 使用抗H3K27ac抗体进行ChIP测定。SP处理后的HCT116细胞作为对照，结果显示为输入染色质的富集倍数。三个独立实验的Mean ± SD。p值是使用学生t检验 （***p < 0.001）统计。E 在HCT116细胞中用siHECTD2和SP处理24 h后EHMT2的WB分析。ACTB被用作内参。使用ImageJ软件对信号强度进行量化。F 在HCT116细胞中用siHECTD2和SP处理24h或CHX处理12h后EHMT2的WB分析。ACTB被用作内参。使用ImageJ软件对信号强度进行量化。G HCT116细胞中用FLAG标记的EHMT2和HA标记的泛素表达载体转染后，再用siHECTD2和SP处理24h或MG132处理6h，HA和FALG抗体的蛋白印记分析。H 在HECTD2敲降和SP共处理的HCT116细胞中使用Muse Caspase 3/7工作溶液进行FACS分析。右上方面板表示凋亡和死细胞的比例（上）。下面的柱状图表示半胱天冬酶3/7活性的定量结果。三个独立实验的Mean ± SD。p值是使用学生t检验 （***p < 0.001） 计算的。 4 EHMT2的敲降参与了CRC细胞的凋亡 EHMT2敲降后的RNA测序结果表明，与siCont对照组相比，GO分析中富集的通路有“凋亡过程”、“细胞周期”和“有丝分裂细胞周期的调节”（图4A）。为了验证SP处理的EHMT2下调是否诱导细胞凋亡，研究者设计了EHMT2的特异性siRNA，并用EHMT2 siRNA处理后进行了细胞生长测定。与siCont对照组相比，通过CV染色和CCK-8测定发现SP处理后EHMT2的敲降抑制了CRC细胞系中的细胞生长（图4B，C）。WB表明EHMT2敲降增加了剪切后的PARP（图4D）。FACS发现敲降EHMT2上调了CRC细胞系中半胱天冬酶3/7的活性（图4E）。与siCont对照组相比，敲降EHMT2增加了早期和晚期凋亡细胞的数量（图4F）。因此，研究者认为SP处理后EHMT2的下调诱导了CRC细胞系中细胞凋亡从而抑制细胞增殖，表明EHMT2是SP诱导细胞凋亡的关键蛋白。 5 在诱导CRC细胞凋亡的过程中TNFAIP1是EHMT2的直接靶标 为了验证EHMT2是直接靶点，siEHMT2处理后进行了ChIP-seq分析，研究SP诱导细胞凋亡后的TNFAIP1基因的表达，因为与siCont组相比，siEHMT2组的TNFAIP1启动子区域的H3K9二甲基化状态降低（图4G）。为了证实这一结果，使用EHMT2 siRNA处理后进行了另一次ChIP测定。研究者设计了两种针对TNFAIP1启动子区域的ChIP引物（P1和P2），并使用抗H3K9me2和抗H3K9ac抗体进行ChIP测定（图4H）。与siCont组相比，敲降EHMT2后TNFAIP1基因启动子区的H3K9二甲基化状态显著降低。此外，TNFAIP1基因启动子区域的H3K9乙酰化增加，表明EHMT2通过改变染色质结构直接调节TNFAIP1的表达（图4I，J）。 图4 EHMT2的敲降参与CRC细胞凋亡。A GO富集通路网络。ClueGO分析EHMT2敲降组和对照组中的GO通路富集网络。功能网络组中的p值在> 0.05处截断 。B 用EHMT2 siRNA和siCont（阴性对照）处理后的EHMT2的qRT-PCR分析。p值是使用学生t检验（**p < 0.01）统计（左）。用siEHMT2和siCont处理48h后进行细胞生长测定，将HCT116和LS174T细胞固定在100%甲醇中并用结晶紫溶液染色。比例尺是200 μm（右）。C CCK-8 测定。用siEHMT2和siCont处理后在培养基中加入CCK-8工作溶液，37°C孵育5分钟。使用酶标仪（450nm）测量细胞生长的强度。p值是使用学生t检验 （***p < 0.001） 统计。D 使用抗EHMT2和抗PARP抗体进行EHMT2敲降后的WB。ACTB被用作HCT116和LS174T细胞的内参。使用ImageJ软件对信号强度进行量化。E 在EHMT2敲降后使用Muse Caspase 3/7工作溶液进行FACS。右上方表示凋亡和死细胞的比例（左图）。半胱天冬酶3/7活性的定量。三个独立实验的Mean ± SD。p值是使用学生t检验（***p < 0.001，**p < 0.01）统计（右图）。F 在EHMT2敲降后对膜联蛋白V染色进行FACS。右下和右上象限分别表示早期和晚期凋亡（左）。细胞凋亡的定量。三个独立实验的Mean ± SD。p值是使用学生t检验（**p < 0.01）（右）统计。G ChIP-seq 分析。TNFAIP1 基因启动子区中 H3K9me2 （siCont） 和 H3K9me2 （siEHMT2） ChIP 信号的代表性 IGV 视图。启动子区域被定义为从转录起始位点（TSS）到TSS上游1 kb的区域。Y 轴刻度反映了使用 deepTools（v3.3.0）的 RPGC（每 10 bp/比例因子的读取次数，平均覆盖率为 1×）的标准化读取次数。H3K9me2 （siCont） 的归一化后为 0–8.67，H3K9me2 （siEHMT2） 的归一化后为 0–7.93。H TNFAIP1启动子区域ChIP引物设计图形摘要。I，J使用抗H3K9me2（I）和抗H3K9ac（J）抗体进行ChIP测定。结果以siEHMT2处理后的HCT116细胞中输入染色质与对照组相比的百分比进行比较表示。三个独立实验的Mean ± SD。p值是使用学生t检验统计（***p < 0.001）。 6 EHMT2对TNFAIP1的表观遗传调控诱导结直肠癌细胞凋亡 EHMT2通过H3K9二甲基化形成异染色质结构从而参与基因表达的负调控。因此，敲降EHMT2后由EHMT2直接调节的候选基因是需要上调的关键基因。TNFAIP1是由IL-6和TNFα诱导的上游反应基因，参与细胞凋亡，DNA修复和DNA合成。在胃癌中，敲降miR-372诱导的TNFAIP1过表达可以调节NF-κB信号通路促进细胞凋亡。在HeLa细胞系中，过表达TNFAIP1可以下调NF-κB信号通路来增加细胞凋亡。因此，研究者选择TNFAIP1作为EHMT2诱导细胞凋亡的靶标。RNA-seq发现在CRC细胞系中，SP处理后和EHMT2敲低后TNFAIP1表达上调， qRT-PCR也证实了这一结果，预示SP下调EHMT2的表达诱导TNFAIP1（图5A）。ICC结果显示相比对照细胞，SP或siEHMT2处理后TNFAIP1的强度增加（图5B）。因此，研究者猜测EHMT2的下调在转录水平上诱导TNFAIP1表达。接下来，为了验证TNFAIP1和敲降EHMT2之间的关系，研究者在表型水平上进行了CV染色和CCK-8的细胞生长实验。与单独siEHMT2处理组相比，EHMT2和TNFAIP1 siRNA共处理的细胞生长恢复（图5C，D）。WB结果显示EHMT2敲降引起的PARP增加可以被siEHMT2和siTNFAIP1共处理减少（图5E）。此外，FACS表明，EHMT2和TNFAIP1 siRNA共处理会降低半胱天冬酶3/7活性（图5F）。因此，TNFAIP1是CRC细胞系中SP处理后EHMT2降解的效应基因。 接下来，为了确认EHMT2和TNFAIP1之间的相互作用，研究者对TCGA数据库的公共CRC RNA-seq数据进行了相关性分析。EHMT2和TNFAIP1呈负相关（图5G；R2 = –0.2；p = 0.04）。因此，研究者认为SP诱导的EHMT2蛋白酶体降解减少了TNFAIP1启动子区域中的H3K9二甲基化；从而上调TNFAIP1增加了CRC细胞的凋亡。
7 人类肠道微生物中细菌的培养基通过上调TNFAIP1来抑制HCT116细胞的生长 为了验证人类微生物衍生的丙酸盐是否通过下调EHMT2来抑制CRC生长，研究者使用人类肠道微生物BT设计了另一个实验。结肠中，拟杆菌属是人类微生物的主要群体，BT是仅次于脆弱拟杆菌的第二大可以分离的细菌。BT 是一种革兰氏阴性严格厌氧菌。这种细菌参与多糖代谢，例如膳食碳水化合物中糖苷键的水解。首先，通过HPLC分析来分析BT培养上清液（Sup）中丙酸盐的产生。HPLC结果显示BT Sup中丙酸盐（2.172 g / l）的产生（图6A）。为了验证BT在结肠癌中的抗肿瘤作用，将BT Sup添加到CRC细胞系的培养基中。与对照组（仅培养基）相比，CV染色和CCK实验发现BT Sup处理组的细胞生长受到显著抑制（图6B，C）。WB实验表明BT Sup处理增加了剪切后的PARP，这意味着BT的丙酸盐可能通过诱导细胞凋亡来抑制CRC细胞系生长（图6D）。接下来，研究者用BT Sup处理HCT116细胞后的做了WB和qRT-PCR，发现BT Sup处理降低了EHMT2的蛋白质水平的表达，但没有降低转录水平（图6E，F）。此外，与对照细胞相比，ICC显示BT处理后细胞中EHMT2的强度显著降低（图6G）。qRT-PCR结果显示BT Sup处理组上调了HECTD2和TNFAIP1表达（图6H）。最后，ICC分析显示BT Sup处理显著增加了TNFAIP1的表达（图6G）。 已有报道发现SCFAs（丙酸盐，丁酸盐）通过抑制HDAC活性诱导组蛋白H4高乙酰化。由于丁酸盐也有与丙酸盐相似的HDAC抑制活性，研究者假设BT Sup中的丁酸盐也可能和SP一样通过HECTD2-EHMT2-TNFAIP1轴，诱导H3K27乙酰化来降低HECTD2，从而抑制结肠癌细胞系的生长。为了验证这一假设，研究者在HCT116细胞中用丁酸钠（SB）处理后进行了细胞生长测定，并在CCK实验中发现了SB处理后细胞生长被抑制（附图S6A）。WB和FACS中观察到剪切后的PARP和半胱天冬酶3/7活性的增加，表明SB处理也诱导细胞凋亡（附图S6B，C）。为了验证SB处理后HECTD2-EHMT2-TNFAIP1轴的作用，qRT-PCR和ICC实验证明SB处理后诱导了HECTD2和TNFAIP1表达（附图S6D，E）。WB和ICC结果显示SB处理后EHMT2表达显著降低。接下来，为了检测SB是否影响H3K27乙酰化，用SB处理HCT116细胞后对H3K27的乙酰化做了WB，与对照组相比，H3K27乙酰化的增加（附图S6F）。此外，在用H3K27乙酰化抗体进行ChIP分析中，研究者清楚地发现H3K27乙酰化状态在HECTD2启动子区域富（附图S6G）。最后在HCT116细胞系中用SB和siHECTD2共处理，SB处理诱导的半胱天冬酶3/7活性因siHECTD2而降低（附图S6H）。因此，研究者认为微生物产生的丁酸盐和SP类似，通过调控HECTD2-EHMT2-TNFAIP1轴和HDAC活性来抑制结肠癌的生长。 研究者还选择了Collinesella aerofaciens（CA）作为阴性对照，一种人肠道中的革兰氏阳性细菌。HPLC分析没有在CA上清液中检测到丙酸盐和丁酸盐（图6I）。使用CA Sup研究HCT116细胞系中的HECTD2-EHMT2-TNFAIP1轴作用。CV染色实验未发现生长抑制（图6J）。qRT-PCR中CA sup略微增加了TNFAIP1的表达，但不影响HECTD2表达（图6K）。此外，WB和ICC未检测到EHMT2和TNFAIP1表达的变化（图6L，M）。综上所述，研究者认为人体微生物产生SCFA（包括BT）在预防结肠癌方面起着重要作用。 8 EHMT2是CRC的治疗靶点 通过分析TCGA数据库结肠癌和正常组织的RNA-seq结果，研究者确定了EHMT2在CRC中的预后值。与低表达的EHMT2组相比，高表达的EHMT2组预后较差（p = 0.043；图7A），表明EHMT2是CRC治疗的潜在靶点。使用了BIX01294抑制剂（EHMT2活性的特异性抑制剂）研究EHMT2作为CRC的治疗靶点。BIX01294处理后，RT-PCR和ICC发现EHMT2活性的降低显著增加了TNFAIP1的表达（图7B，C），CV染色显示细胞生长下降（图7D）。BIX01294处理后的ChIP测定中发现H3K9me2降低，TNFAIP1启动子区域的H3K9ac增加（图7E）。此外，BIX01294处理增加了的剪切后的PARP（WB）和半胱天冬酶3/7活性（FACS）（图7F，G）。BIX01294处理后的CRC细胞系中，早期和晚期凋亡细胞增加（图7H）。为了验证EHMT2失活在体内的CRC生长抑制作用，我们用BIX01294进行了移植瘤实验发现BIX01294治疗组的肿瘤大小与对照组相比减小（图7I-K）。 图7 EHMT2是CRC的治疗靶点。A GTEx 数据库的CRC样本中总生存率的 Kaplan-Meier 图。与高EHMT2组相比，低EHMT2组的生存率显著提高（p = 0.043）。B BX01294处理后TNFAIP1的qRT-PCR分析。三个独立实验的Mean ± SD。p值是使用学生t检验 （***p < 0.001） 统计的。C TNFAIP1的免疫细胞化学分析。BIX01294处理的HCT116细胞用100%甲醇固定，并用抗TNFAIP1（Alexa Fluor 488，绿色）和DAPI（蓝色）染色。比例尺为50 μm。D BIX01294处理后的细胞生长实验。将HCT116和LS174T细胞固定在100%甲醇中并用结晶紫溶液染色后进行。比例尺为200 μm。E 使用抗H3K9me2（左）和抗H3K9ac（右）抗体进行ChIP测定。结果表示为BIX01294处理后HCT116细胞中染色质与对照组的百分比。三个独立实验的Mean ± SD。p值是使用学生t检验计算的（***p < 0.001）。F 使用抗PARP和抗EHMT2抗体进行BIX01294处理后的WB。ACTB被用作HCT116和LS174T细胞的内参。使用ImageJ软件对信号强度进行量化。G BIX01294处理后，使用Muse Caspase 3/7工作溶液进行FACS分析。右上方表示凋亡细胞和死细胞的比例（左图）。右图表示半胱天冬酶3/7活性的定量。三个独立实验的Mean ± SD。p值是使用学生t检验（***p < 0.001，**p < 0.01）计算得出的。H 在BIX01294处理后对膜联蛋白V染色进行FACS分析。右下和右上象限分别提示早期凋亡和晚期凋亡。右图是细胞凋亡的定量。三个独立实验的Mean ± SD。p值是使用学生t检验（***p < 0.001）计算得出的。I–K BIX01294处理抑制裸鼠移植瘤的肿瘤。在HCT116细胞植入后，对照组或BIX01294每周腹腔注射三次。I 第23天肿瘤的宏观图像，J肿瘤体积[使用双端方差分析计算p值（***p < 0.001）]和K肿瘤重量[使用学生t检验计算p值（*p < 0.01）]。 9 丙酸盐和BIX01294在HCT116细胞系3D球体模型中的协同效应 为了验证在结肠癌中，丙酸盐作用和SP和EHMT2抑制剂（BIX01294）共处理协同作用，研究者使用ULA板的3D球体模型系统。3D球体模型系统可以反映肿瘤生理条件和复杂结构，是用于癌症治疗的靶点研究和抗癌药物开发的有效模型。首先，在ULA板中培养HCT116细胞，在第4天检测到HCT116细胞的球状体。与阴性对照（仅PBS）相比，SP处理使球体的聚集松动（图 8A）。为了检测球体的解离，使用E-钙粘蛋白（CDH1）——一种细胞聚集的标志物，E-钙粘蛋白的表达会因球体解离而降低。与对照组相比，qRT-PCR显示SP处理组的E-钙粘蛋白的表达降低。此外，SP处理后观察到与前面细胞实验一致的结果：HECTD2和TNFAIP1上调（图8B）；WB发现SP处理后EHMT2表达降低；与PBS相比，SP处理增加了剪切后的PARP（图8C）。因此，研究者证实了SP在3D培养系统中的抗肿瘤作用，表明产生SP的微生物可以预防结肠癌的发展。 接下来，为了验证SP和EHMT2抑制剂共处理的协同作用，使用HCT116细胞系的3D培养系统。在明场图像中，和对照组和单处理组（SP或BIX01294）相比，第2天SP / BIX01294共处理组中的共培养球体解离最强，这表明第4天（仅SP）和第2天（SP和BIX01294）之间存在协同效应（图8D）。qRT-PCR显示共处理组的HECTD2和TNFAIP1的表达显著增加（图8E）。此外，与其他组相比，共处理组的剪切后的PARP增加（图8F）。综上所述，对于结肠癌治疗，如果患者在摄入产生丙酸盐的微生物时使用EHMT2抑制剂，预计会有更好的抗肿瘤作用。 图8 SP和BIX01294在3D球体模型中的协同效应。A 使用HCT116细胞系进行3D球体模型培养。用SP（0和10mM）处理的细胞接种到ULA板上并孵育4天。每天在显微镜下拍摄细胞。比例尺是500 μm（左）。4天时球体增大（右）。红线：解离的细胞。白线：聚合单元格。B 4天后对 HECTD2、TNFAIP1 和 CDH1 进行qRT-PCR。三个独立实验的Mean ± SD。p值是使用学生t检验统计的（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。C 使用抗EHMT2和抗PARP抗体进行SP处理后的WB。ACTB被用作内参。D 用HCT116细胞系进行3D球体模型培养。将SP和BIX01294共处理的细胞接种到ULA板上并孵育2天。每天在显微镜下拍摄细胞。比例尺为500 μm。2天内球体扩大。红线：解离的细胞。白线：聚合单元格（左）。使用ImageJ软件测量球体的大小（右）。三个独立实验的Mean ± SD。p值是使用学生t检验（***p < 0.001）统计的。E 2天后对HECTD2、TNFAIP1和CDH1进行qRT-PCR。三个独立实验的Mean ± SD。p值是使用学生t检验统计的（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。F 使用抗EHMT2和抗PARP抗体进行SP处理后的WB。ACTB被用作内参。 讨论 SCFAs如丁酸盐（SB）和丙酸盐（SP）可作为HDAC抑制剂，影响基因的转录调控。在CRC中用SCFAs治疗后，观察到启动子区域的组蛋白乙酰化可以上调细胞凋亡相关基因，这意味着SCFAs是有用的抗肿瘤的抑制剂。此外，产生SCFAs的微生物也被发现对健康有益。迄今为止，SCFAs的基因调控主要发生在转录水平上， 目前还没有研究表明结肠癌中翻译后修饰与SCFA治疗之间的关系。因此，本研究发现SP增加CRC细胞中EHMT2蛋白酶体降解，提出了SP在CRC细胞系中的新功能。 为了快速消除细胞中的蛋白质，泛素-蛋白酶体途径是新蛋白质合成过程中小肽循环利用的有效途径。在蛋白酶体降解途径中，由E3复合蛋白与蛋白酶体结合的多泛素化蛋白被展开并降解。最近文献报道蛋白酶体本身是癌症治疗的潜在靶点。在CRC细胞系中，相比单独SP处理组，SP和MG132共处理后挽救了EHMT2的表达。此外， CHX和SP共处理组中EHMT2的降解速度更快，表明SP可以诱导EHMT2蛋白酶体降解（图2F，G）。RNA-seq和qRT-PCR结果显示SP和BT Sup处理组中的HECTD2上调从而促进EHMT2降解。GENT分析（http://gent2.appex.kr/gent2/）发现对照组和CRC样品之间HECTD2的表达水平没有差异（附图S7），暗示SP在CRC中引发的HECTD2上调是通过诱导多泛素化促进EHMT2蛋白酶体降解。 1 肠道微生物产生的丙酸盐可以诱导结肠癌的细胞凋亡 为了研究SP在CRC细胞系中的抗肿瘤活性，研究者选择适当的SP浓度（2.5~5mM）进行实验，发现在HCT116和LS174T细胞系中SP可以诱导细胞凋亡。SCFAs，如丙酸盐，丁酸盐和乙酸盐是人体结肠中的微生物利用膳食纤维发生的发酵产物。在人结肠腔中，丙酸盐和乙酸盐的浓度为10~100mM；因此，研究者认为本研究中使用的丙酸盐浓度是适合测试该分子的抗肿瘤的作用浓度。此外，使用hPSC衍生的肠道类器官进行了细胞生长测定。在图1I和J中2.5和5mM SP不影响hIO细胞的活力，HCT116细胞在丙酸盐组中受到显著抑制。 本研究使用了BT Sup来研究CRC细胞系中的SP效应。BT Sup的HPLC结果揭示了各种代谢物。其中HCT116细胞系中乳酸，乙酸盐和丁酸盐的IC50值分别为29.21，27.51和1.38 mM。WB中只有丁酸盐处理诱导了HCT116细胞系中剪切PARP的增加（附图S8）。因此，研究者认为BT Sup的丙酸盐和丁酸盐通过调节HECTD2-EHMT2-TNFAIP1轴抑制了HCT116细胞系的增殖。单独BT并不能代表肠道微生物群。然而，由于SCFAs在结肠癌中的作用机制尚不清楚，因此在这项研究中，研究者专注于SP诱导的结肠癌细胞凋亡的分子机制。最后，研究者确定了SP诱导的结肠癌细胞凋亡的表观遗传调控和分子靶标。由于需要使用SP产生菌进一步评估这个分子机制，研究者们选择了BT上清液并通过BT sup处理确认了HECTD2-EHMT2-TNFAIP1轴的作用，这意味着肠道中产生SP的细菌（包括BT）可以抑制结肠癌的增殖并诱导细胞凋亡。 2 SP和BIX01294可以协同抑制CRC 为了验证SP和BIX01294的协同作用，研究者采用三维（3D）球体模型系统，发现SP处理通过HECTD2-EHMT2-TNFAIP1轴增加了CRC的细胞凋亡。在单独SP处理组中，培养4天观察到细胞凋亡。然而，在SP和BIX01294共处理时，剪切后的PARP在2天时增加。因此，研究者认为SP下调EHMT2和BIX01294抑制EHMT2活性可能对CRC 3D球体模型的抑制具有协同效应。然而，尽管3D模型可以模拟肿瘤生理条件和结构复杂性，但3D球体模型系统在确认体外结果方面仍然存在局限性。因此，为了克服体外试验的局限性，需要进一步的体内研究来验证肠道微生物合成的SP与肠道CRC之间的直接联系。 迄今为止，SP在癌症中的临床应用尚未进行，尽管SP在几种类型的肿瘤中显示出抗肿瘤作用，SCFAs在维持上皮细胞促进结肠健康方面起着关键作用。因此，尽管尚未进行SP的临床研究，但根据体外结果，研究者建议：（1）摄入有益的可以产生SP的微生物以抑制CRC生长;（2）利用膳食纤维增加丙SP的生产;（3）筛选SP高产量的新型微生物。 结论 丙酸盐在结肠癌中通过促进蛋白酶体降解降低了EHMT2的蛋白质稳定性。EHMT2表达的降低也降低了TNFAIP1启动子区域中组蛋白H3K9二甲基化的水平。最后，通过表观遗传调控的TNFAIP1上调抑制了CRC增殖（图9）。因此，本研究的结果表明，结肠中微生物对预防结肠癌的重要性，并且SCFAs（例如丙酸盐）和HMT特异性抑制剂可能对结肠癌治疗显示出协同作用。此外，强调CRC患者的饮食治疗可以帮助治愈CRC。
图9 SP诱导的CRC细胞凋亡的示意图。人类肠道微生物组衍生的丙酸盐通过上调HECTD2降低了EHMT2的蛋白质稳定性。随后，TNFAIP1作为EHMT2的新型直接靶点可以诱导了结肠癌的凋亡。 |
图2 EHMT2是丙酸盐诱导的结肠癌细胞凋亡的靶标。A EHMT2在TCGA数据库中正常和CRC样品中的表达。B EHMT2的免疫组化分析。结肠癌组织微阵列来自BioChain（https://www.biochain.com）。比例尺为200 μm。C RT-PCR分析丙酸钠处理后的HCT116和LS174T细胞中EHMT2的表达水平。ACTB被用作内参（上部）。下方的柱状图是EHMT2表达的qRT-PCR分析。三个独立实验的Mean ± SD。p值是使用学生t检验（n.s. 表示不显著）统计的。D 使用抗EHMT2处理给予丙酸钠后的蛋白质印迹分析。ACTB被用作HCT116和LS174T细胞的内参。使用ImageJ软件对信号强度进行量化。E EHMT2的免疫细胞化学分析。给予丙酸钠后的HCT116细胞用100%甲醇固定，并用抗EHMT2（Alexa Fluor 488，绿色）和DAPI（蓝色）进行染色。比例尺为50 μm。F 使用抗EHMT2对SP处理24h和MG132处理6h后的蛋白质印迹分析。ACTB被用作HCT116和LS174T细胞的内参。使用ImageJ软件对信号强度进行量化。G SP处理24 h后EHMT2和环己酰亚胺（CHX）12和24 h的G蛋白质印迹分析，以ACTB为内参。使用ImageJ软件对信号强度进行量化。H SP诱导 EHMT2 的泛素化。用FLAG标记的EHMT2和HA标记的泛素表达载体共转染后， SP处理24h和MG132处理6 h，使用HA和FLAG抗体进行蛋白质印迹分析。 
图5 EHMT2对TNFAIP1的负调节诱导CRC细胞凋亡。A SP或siEHMT2处理后的RNA-seq中TNFAIP1的表达水平（上部）。SP或siEHMT2处理后TNFAIP1的qRT-PCR。三个独立实验的Mean ± SD。p值是使用学生t检验 （***p < 0.001） 统计。B TNFAIP1的免疫细胞化学分析。SP或siEHMT2处理的HCT116细胞用100%甲醇固定，并用抗TNFAIP1（Alexa Fluor 488，绿色）和DAPI（蓝色）染色。比例尺是50 μm。C，D siTNFAIP1和siEHMT2共转染48h后细胞生长测定。将HCT116细胞固定在100%甲醇中并用结晶紫溶液染色。比例尺为200 μm （C）。将CCK-8溶液加入培养基中，37°C孵育5分钟。使用酶标仪（450nm）测量细胞生长的强度。三个独立实验的Mean ± SD。p值是使用学生t检验 （***p < 0.001）统计（D）。E 使用抗 PARP、抗 EHMT2 和抗 TNFAIP1 抗体对 siEHMT2 和 siTNFAIP1 共转染后的WB。ACTB被用作HCT116细胞的内参。使用ImageJ软件对信号强度进行量化。F siEHMT2和siTNFAIP1共转染后，使用Muse Caspase 3/7工作溶液进行FACS分析。右上方面板表示凋亡细胞和死细胞比例（上图）。下图是半胱天冬酶3/7活性的定量。三个独立实验的Mean ± SD。p值是使用学生t检验 （***p< 0.001） 计算的。G GTEx 中 EHMT2 和 TNFAIP1 的散点图。虚线表示 EHMT2 和 TNFAIP1 线性回归线。采用Person相关法计算两个基因之间的p值和相关系数（r）。 
图6 BT培养的上清液通过丙酸盐诱导细胞凋亡抑制HCT116和LS174T细胞的生长。A 使用高效液相色谱（HPLC）系统（1200系列，美国安捷伦）测定代谢物的浓度，该系统具有折射率检测器（RID）和离子交换柱（300×78 mm；Aminex HPX-87H；Bio-Rad，美国）。流动相为2.5 mM H2SO4，流速为0.6 ml/min，柱温为65 °C，RID保持在45 °C。B，C BT Sup处理48h后细胞生长测定（结晶紫染色和CCK-8测定）。将HCT116细胞固定在100%甲醇中并用结晶紫溶液染色。比例尺为200 μm。（B）将CCK-8溶液加入细胞培养基中，37°C孵育5 min。使用酶标仪（450nm）测量细胞生长的强度（C）。三个独立实验的Mean ± SD。p值是使用学生t检验 （***p < 0.001）统计的。D 使用抗PARP进行BT Sup处理后的WB。ACTB被用作HCT116细胞的内参。使用ImageJ软件对信号强度进行量化。E BT Sup处理后EHMT2表达的qRT-PCR。三个独立实验的Mean ± SD。p值是使用学生t检验 （**p < 0.01） 统计的。F 使用抗EHMT2进行BT sup处理后的WB。ACTB是内参。使用ImageJ软件对信号强度进行量化。G EHMT2和TNFAIP1的免疫细胞化学分析。BT Sup处理的HCT116细胞用100%甲醇固定，并用抗EHMT2和抗TNFAIP1（Alexa Fluor 488，绿色）和DAPI（蓝色）染色。比例尺为50 μm。H BT Sup处理后HECTD2和TNFAIP1的qRT-PCR。三个独立实验的Mean ± SD。p值是使用学生t检验统计的（***p < 0.001，**p < 0.01）。I 使用高效液相色谱（HPLC）系统测定代谢物的浓度。J CA Sup处理48h后进行细胞生长测定（结晶紫染色），将HCT116细胞固定在100%甲醇中并用结晶紫溶液染色。比例尺是200 μm。K CA Sup处理后 EHMT2、HECTD2 和 TNFAIP1 的mRNA表达的qRT-PCR 。三个独立实验的Mean ± SD。p值是使用学生t检验统计的（*p < 0.05，n.s. 不显著）。L 使用抗 EHMT2 和抗 PARP 抗体进行 CA Sup处理后的WB。ACTB被用作内参。使用ImageJ软件对信号强度进行量化。M EHMT2和TNFAIP1的免疫细胞化学分析。CA Sup处理的HCT116细胞用100%甲醇固定，并用抗EHMT2，抗TNFAIP1（Alexa Fluor 488，绿色）和DAPI（蓝色）染色。比例尺为50 μm。 
