具核梭杆菌促进结直肠癌细胞与内皮细胞粘附及其外渗和转移

编译：微科盟索亚，编辑：微科盟索亚、江舜尧。

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导读   2022年2月27日，浙江大学医学院陈淑洁，姒健敏，卓巍团队等人在Gut Microbes发表题为《Fusobacterium nucleatum promotes colorectal cancer cells adhesion to endothelial cells and facilitates extravasation and metastasis by inducing ALPK1/NF-κB/ICAM1 axis》的文章。肿瘤细胞转移是结直肠癌(CRC)患者死亡的主要原因，扩散的肿瘤细胞与内皮细胞的粘附是其外渗和进一步转移的关键步骤。前人的研究表明了肠道微生物群-宿主相互作用在CRC恶性肿瘤中的重要作用，据报道，具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)可增加CRC细胞的增殖和侵袭活性。然而，具核梭杆菌在CRC细胞和内皮细胞之间的相互作用以及随后的外渗中的潜在功能和潜在机制仍不清楚。在本研究中，我们发现具核梭杆菌可以通过诱导ICAM1的表达增强了CRC细胞与内皮细胞的粘附，促进了肿瘤细胞的外渗和转移。从机制上来看，我们发现具核梭杆菌诱导一种新的模式——识别受体ALPK1激活NF-κB通路，导致ICAM1上调。有趣的是，CRC患者肿瘤组织中具核梭杆菌的丰富度与ALPK1和ICAM1的表达水平呈显著正相关。此外，ALPK1或ICAM1的高表达水平与CRC患者较短的存活时间显著相关。这项研究为肠道微生物群在参与CRC细胞进一步转移中的作用提供了新的见解。   关键词：肠道微生物，黏附，ICAM1，ALPK1，结直肠癌转移    

论文ID

原名：Fusobacterium nucleatum promotes colorectal cancer cells adhesion to endothelial cells and facilitates extravasation and metastasis by inducing ALPK1/NF-κB/ICAM1 axis

译名：具核梭杆菌通过诱导ALPK1/NF-κB/ICAM1轴促进结直肠癌细胞与内皮细胞的粘附及其外渗和转移

期刊：Gut Microbes

IF：10.245

发表时间：2022.02.27

通讯作者：陈淑洁，姒健敏，卓巍

通讯作者单位：浙江大学医学院

DOI号：10.1080/19490976.2022.2038852

实验设计

实验材料：结直肠癌细胞系（LoVo，HCT116）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）；F. nucleatum strain 25586和10953，A. muciniphila BAA-835，B.adolescentis strain 15703。收集98对CRC患者新鲜肿瘤和相邻非肿瘤组织；采集72例CRC患者和66例健康人粪便样本。构建人源性组织异种移植（patient-derived xenografts，PDX）模型。进行细胞培养粘附和转移试验，小鼠试验，宏基因组分析，转录组分析，RT-PCR，免疫组织化学和免疫印迹分析，免疫荧光和共聚焦显微镜。探究具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）促进结直肠癌细胞与内皮细胞的粘附及外渗和转移的机制。

结果

1 具核梭杆菌通过上调ICAM1促进CRC细胞与内皮细胞的粘附与外渗

在我们研究肠道微生物群在CRC恶性肿瘤细胞中的作用时，培养CRC细胞的过程中发现了一个有趣的现象，与大肠杆菌（Escherichia coli）或磷酸盐缓冲盐（PBS）对照相比，具核梭杆菌处理可以提高CRC细胞与细胞的相互作用能力。众所周知，扩散的肿瘤细胞粘附到内皮细胞是其外渗和进一步转移的关键步骤。具核梭杆菌诱导的CRC细胞粘附能力可能促进其与内皮细胞的相互作用和外渗。为了验证我们的假设，我们设计了一个肿瘤细胞-内皮细胞相互作用模型。将人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs）移植于培养板中直至完全融合。然后将用具核梭杆菌（具核梭杆菌 strain 25586）、大肠杆菌或PBS对照处理的带GFP标记的HCT116细胞添加到HUVEC单层中。15分钟后将未结合的肿瘤细胞冲洗干净，分析粘附的HCT116细胞（图1a）。与大肠杆菌处理或PBS对照相比，具核梭杆菌处理显著增强了HCT116细胞对HUVEC的粘附（图1b）。同时，与我们之前的研究结果一致，具核梭杆菌处理显著促进了HCT116细胞（图1c）和人结肠癌细胞（LoVo）细胞（补充图1a）的细胞迁移。此外，我们还使用另一个具核梭杆菌菌株（具核梭杆菌 strain 10953）来评估具核梭杆菌的一般特性。结果发现，具核梭杆菌10953处理，与具核梭杆菌25586相似，可以显著促进CRC细胞与内皮细胞粘附和CRC细胞迁移（补充图1b-c），表明这可能是具核梭杆菌的一般特性。有趣的是，当我们使用革兰氏阴性细菌Akkermansia muciniphila （A. muciniphila）和革兰氏阳性细菌Bifidobacterium adolescentis （B. adolescentis）来鉴定具核梭杆菌的特定表型时，我们发现具核梭杆菌处理显著促进CRC细胞与内皮细胞的粘附以及迁移能力，但对A. muciniphila或B. adolescentis没有效果（补充图1d-e）。

为了证实在体外实验结果，我们将具核梭杆菌处理的带GFP标记的HCT116细胞通过静脉注射到SCID小鼠中。24小时后用PBS灌注肺血管，并分析在肺中的定植HCT116细胞（图1d）。与大肠杆菌或PBS处理相比，具核梭杆菌处理显著增加了HCT116细胞的跨内皮细胞的侵袭和定植（图1e）。为了探究具核梭杆菌诱导的CRC细胞与细胞间粘附能力的潜在机制，我们在有或没有具核梭杆菌处理（GSE171611）的HCT116细胞中进行了RNA测序。如图1f所示，在具核梭杆菌处理上调基因中（log2倍数变化 > 1，p.adj < 0.05）、细胞与细胞粘附的GO、细胞粘附的KEGG途径之间重叠的ICAM1基因。为了证实我们的分析结果，我们检测了具核梭杆菌处理的CRC细胞中ICAM1的蛋白质表达，并观察到ICAM1在具核梭杆菌处理的HCT116细胞和LoVo细胞中确实显著增加（图1g）。更重要的是，我们用从CRC患者产生的肿瘤组织建立了人源性组织异种移植（patient-derived xenografts，PDX）模型。3名接受具核梭杆菌体外治疗的PDX肿瘤组织均显示ICAM1水平显著上调（图1h）。

图1. 具核梭杆菌促进CRC细胞与内皮细胞的粘附，并通过上调ICAM1促进外渗。（a）体外粘附试验的示意图；（b）对用具核梭杆菌、大肠杆菌或PBS对照处理 6小时的GFP标记的HCT116细胞进行粘附试验；显示了具有代表性的图像（左），并通过在五个视野（右）中计数来量数量，比例尺100 μm；（c）HCT116细胞用具核梭杆菌、大肠杆菌或PBS对照处理6小时并进行迁移测定；迁移的细胞在18小时后通过在五个视野中计数进行量化，比例尺，100 μm；（d）体内癌细胞外渗模型的示意图；（e）通过免疫荧光测定对小鼠肺组织中定植的带GFP标记的HCT116细胞进行定量，其中肺切片用血管内皮细胞CD31（红色）的标记物染色，细胞核用DAPI（蓝色）复染，比例尺100 μm；（f）采用Venn图分析256个在RNA测序中mRNA表达显著上调的基因（倍数变化 > 2，p. adj < 0.05 ）、880个在细胞与细胞粘附GO（GO：0098609）的基因和133个在细胞黏附分子KEGG通路中具有关键功能的基因（hsa04514）；（g）通过蛋白质印迹分析以检测用具核梭杆菌、大肠杆菌或PBS对照处理的HCT116细胞和LoVo细胞中ICAM1的蛋白水平；（h）用具核梭杆菌或PBS对照处理的PDX肿瘤组织中ICAM1的定量RT-PCR分析；数据显示为平均值±SD，** P< 0.01, *** P < 0.001, **** P< 0.0001。

2  ICAM1参与具核梭杆菌诱导的CRC细胞与内皮细胞的粘附和迁移

为了进一步了解ICAM1在CRC发展中的功能，我们使用两种特异性siRNA使HCT116细胞中的ICAM1沉默（图2a-b）。下调的ICAM1显著抑制了HCT116细胞与HUVEC的粘附（图2c）。同时，如图2d所示，ICAM1沉默显示出显著的肿瘤迁移抑制作用。同样，在LoVo细胞中也观察到了类似的结果（补充图2a-c）。为了进一步确定具核梭杆菌是否以ICAM1依赖性的方式发挥致癌功能，我们在CRC细胞中进行了ICAM1功能丧失测定。当我们在HCT116细胞（图2e-f）和LoVo细胞（补充图2d-e）中沉默ICAM1时，具核梭杆菌处理的CRC细胞中ICAM1的上调mRNA和蛋白质水平显著降低。正如预期的那样，ICAM1下调消除了具核梭杆菌介导的HCT116细胞与内皮细胞粘附的促进作用（图2g）。此外，ICAM1的沉默显著逆转了具核梭杆菌诱导的细胞迁移能力增加（图2h，补充图2f），这表明了ICAM1在维持由具核梭杆菌介导的肿瘤细胞功能中发挥了重要的作用。综上所述，我们认为ICAM1参与了CRC细胞与内皮细胞的粘附和具核梭杆菌体外诱导的迁移。

图2. ICAM1参与了具核梭杆菌诱导的CRC细胞与内皮细胞的粘附和体外迁移。分别用靶向ICAM1的2个siRNA或对照siRNA转染HCT116细胞的ICAM1的定量RT-PCR（a）和蛋白质印迹分析（b）；（c-d）用特定的siRNA转染的HCT116细胞的粘附试验（c）和迁移试验（d）；在24小时观察迁移的细胞，比例尺100 μm；（e-f）在HCT116细胞中进行定量RT-PCR（e）和蛋白质印迹分析（f）；用特定的siRNA转染，然后与具核梭杆菌或PBS共培养；（g-h）用特定的siRNA转染的HCT116细胞与具核梭杆菌共培养，并进行粘附试验（g）和迁移试验（h），在18小时后观察迁移的细胞，比例尺100 μm；数据显示为平均值±SD，** P< 0.01, *** P < 0.001, **** P< 0.0001。

3  ICAM1参与具核梭杆菌介导的CRC细胞在体内外渗和转移

为了进一步评估ICAM1在具核梭杆菌介导的体内跨内皮侵袭和定植中的作用，我们降低了带GFP标记的HCT116细胞和用具核梭杆菌处理的细胞中的ICAM1表达。癌细胞外渗试验结果表明，具核梭杆菌显著促进HCT116细胞外渗，而敲低ICAM1则显著逆转HCT116细胞的跨内皮侵袭和定植（图3a）。此外，我们利用基于慢病毒的shRNA建立了稳定的ICAM1敲低HCT116细胞（图3b）。与我们之前的研究结果一致，ICAM1的敲低显著降低了具核梭杆菌诱导的细胞迁移能力（图3c）。我们用上述细胞静脉内接种小鼠以测量肺转移。来自肺部的图像和H&E染色的结果显示，具核梭杆菌显著增加了转移病灶的数量，而HCT116细胞中ICAM1的敲低显著减少了具核梭杆菌诱导的肺部病灶转移（图3d-e）。总之，这些数据表明具核梭杆菌通过体内ICAM1的上调促进CRC细胞的外渗和转移。

图3. ICAM1参与了具核梭杆菌介导的CRC细胞在体内外渗和转移。（a）用两种靶向ICAM1的siRNA转染的带GFP标记的HCT116癌细胞，与具核梭杆菌或PBS共培养在体内的外渗模型；通过免疫荧光法测定肺组织中定植的HCT116细胞，比例尺100 μm；（b-c）基于慢病毒稳定感染CAM1的shRNA或对照shRNA的HCT116细胞与具核梭杆菌或PBS对照共培养，并进行蛋白质印迹分析（b）和迁移测定（c），在18小时后对迁移的细胞进行定量，比例尺，100 μm；（d-e）将用具核梭杆菌或PBS处理的ICAM1敲低HCT116细胞尾静脉注射到裸鼠体内以发展肺转移；具有代表性的肺部切片和H&E染色图（d），箭头表示转移结节；每只小鼠的肺转移结节数（e）；数据显示为平均值±SD，** P< 0.01, *** P < 0.001, **** P< 0.0001。

4  具核梭杆菌 通过激活NF - κ B信号通路上调ICAM1的表达

接下来我们试图探讨具核梭杆菌上调ICAM1表达的机制。KEGG通路分析和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）的RNA测序结果表明，具核梭杆菌感染激活了NF-κB信号通路（图4a-b）。蛋白质印迹分析表明，经具核梭杆菌处理后，HCT116细胞（图4c）和LoVo细胞（补充图3a）中NF-κB亚基p65磷酸化水平显著升高，NF-κ B抑制剂I κ B α磷酸化水平显著升高，而在大肠杆菌和PBS处理不明显。免疫荧光试验也显示NF-κ B亚基p65在具核梭杆菌处理的细胞中的核定位序列显著增加（图4d，补充图3b）。总的来说，我们的结果表明NF-κ B信号传导在CRC细胞中被具核梭杆菌处理激活。我们对激活的NF-κB通路是否参与了ICAM的调控产生了疑问。BAY11-7082是一种NF-κ B抑制剂，可用于治疗感染具核梭杆菌的CRC 细胞。定量RT-PCR和蛋白质印迹分析均表明，当HCT116细胞（图4e，f）和LoVo细胞（补充图3c-d）用NF-κ B处理时，由具核梭杆菌感染诱导的ICAM1上调显著减弱。此外，p65的敲低还抑制了具核梭杆菌诱导的HCT116细胞（图 4g-h）和LoVo细胞（补充图3e-f）中的ICAM1上调。这些结果表明，CRC细胞中ICAM1的上调是由于具核梭杆菌激活了NF-κB信号通路的传导。正如预期的那样，HCT116细胞中p65的敲低显著降低了具核梭杆菌介导的对内皮细胞的粘附以及迁移能力的促进（图4i-j）。在LoVo细胞中也观察到类似的结果（补充图3g）。此外，我们在p65缺失的CRC细胞中重新引入ICAM1水平，发现ICAM1的异位表达可以挽救p65沉默对细胞粘附和迁移的抑制作用（图 4k-l，补充图3h-i）。总之，这些结果表明具核梭杆菌处理通过激活NF-κB 信号通路上调ICAM1。

图4. 具核梭杆菌通过激活NF-κB信号通路上调ICAM1的表达。（a）对503个上调基因的KEGG通路分析，RNA测序存在显著差异；（b）GSEA显示在有或没有具核梭杆菌处理的HCT116细胞中与NF-κB信号通路相关的差异表达基因簇；（c）用具核梭杆菌、大肠杆菌或PBS对照处理的HCT116细胞中磷酸化-I κ Bα、NF-κ B亚基p65和磷酸化-p65的蛋白质印迹分析；（d）免疫荧光检测NF-κ B p65在HCT116细胞中的分布；细胞用p65特异性抗体（绿色）染色，细胞核用DAPI（蓝色）染色，比例尺20 μm；（e-f） HCT116细胞与具核梭杆菌或PBS对照共培养，然后用NF-κ B抑制剂BAY11-7082处理；定量R -PCR（e）和蛋白质印迹分析（f）；（g-h）HCT116细胞转染靶向p65的两个siRNA后，与具核梭杆菌或PBS对照组共培养。定量RT-PCR（g）和蛋白质印迹分析（h）；（i-j）标记处理HCT116细胞的黏附实验（i）和迁移实验（j），8小时后观察迁移细胞，比例尺100 μm；（k-l）用指定的质粒转染的P65敲低的HCT116细胞用于蛋白质印迹分析（k）和粘附试验（l），比例尺，100 μm；数据显示为平均值±SD，** P< 0.01, *** P < 0.001, **** P< 0.0001。

5  ALPK1介导对具核梭杆菌感染的NF-κB依赖性反应

接下来我们研究了可以向NF-κB通路传递信号并介导具核梭杆菌功能的上游调控因子。有研究表明，Toll样受体家族参与了肠道菌群-宿主相互作用系统，并且TLR4/MYD88反应在具核梭杆菌干预后被激活。然而，我们在具核梭杆菌处理的HCT116细胞中沉默TLR4或MYD88，发现敲低TLR4或MYD88并不能逆转具核梭杆菌诱导的黏附能力的提升（补充图4a）。有趣的是，前人的研究已经证实，具核梭杆菌对经历非专性细胞内阶段的CRC细胞具有独特的侵袭潜力，并且ALPK1可能作为革兰氏阴性细菌中存在的ADP-Hep的细胞质中的新模式识别受体。因此，除了TLR4/MYD88在细胞膜上级联外，具核梭杆菌还可能通过ALPK1激活NF-κ B通路。为了验证这一假设，我们通过具核梭杆菌、大肠杆菌或PBS对照处理的HCT116细胞，发现具核梭杆菌处理后ALPK1蛋白水平显著升高（图5a）。为了进一步明确ALPK1是否参与了具核梭杆菌介导的NF-κB激活的调控，我们在HCT116细胞中利用两个针对ALPK1不同区域的siRNA敲除ALPK1（图5b-c）。蛋白质印迹分析表明，沉默ALPK1可阻止NF-κ B通路被具核梭杆菌感染而激活（图5d），这也通过NF-κ B p65的核定位的免疫荧光测定得到验证（图5e）。在LoVo细胞中也观察到类似的结果（补充图4b - d）。这些结果表明，具核梭杆菌可以通过上调ALPK1来激活NF-κ B通路。

由于具核梭杆菌能够激活ALPK1/NF-κ B途径，我们希望探究该途径是否可能参与 ICAM1的调节。有趣的是，我们观察到当ALPK1在HCT116细胞（图5d）和LoVo细胞（补充图4c）中沉默时，具核梭杆菌不能上调ICAM1的表达，这表明了ALPK1在具核梭杆菌上调ICAM1依赖性NF-κB途径中的重要性。随后，我们试图探究ALPK1是否介导了具核梭杆菌在CRC发展中的功能。正如预期的那样，当在具核梭杆菌处理的HCT116细胞中敲除ALPK1时，具核梭杆菌介导的CRC细胞与内皮细胞的粘附减少（图5f）。同时，沉默ALPK1显著损坏了具核梭杆菌对细胞迁移的致癌作用（图5g，补充图4e）。此外，当我们恢复了ALPK1缺失的CRC 细胞中的ICAM1表达，发现ICAM1的异位表达显著逆转了ALPK1沉默对细胞粘附和迁移的抑制作用（图5h-i，补充图4f-g）。总之，这些结果表明了具核梭杆菌通过ALPK1/NF-κ B/ICAM1轴促进CRC细胞与内皮细胞粘附以及CRC细胞迁移。为了探索具核梭杆菌对ALPK1/NF-κB/ICAM1轴的特异性，我们进一步探究了用A. muciniphila或B. adolescentis处理的CRC细胞中ALPK1、NF-κ B信号传导和ICAM1的蛋白水平。蛋白质印迹分析显示A. muciniphila处理，可以轻微激活ALPK1/NF-κ B途径（补充图 4h-i），但B. adolescentis没有效果。有趣的是，具核梭杆菌处理对ALPK1/NF-κ B信号传导以及ICAM1表达水平的刺激作用显著强于A. muciniphila处理（补充图4h-i）。此外，具核梭杆菌10953 还可以显著激活HCT116细胞或LoVo细胞中的ALPK1/NF-κB/ICAM1信号传导，与具核梭杆菌25586相当（补充图4j-k）。

图5. ALPK1介导对具核梭杆菌感染的NF-κB依赖性反应。（a）用具核梭杆菌、大肠杆菌或PBS对照处理的HCT116细胞中ALPK1的蛋白质印迹分析；分别转染靶向ALPK1的siRNA或对照siRNA的HCT116细胞中的ALPK1的定量RT-PCR（b）和蛋白质印迹分析（c）；（d）siRNA转染的HCT116细胞与具核梭杆菌或PBS对照共培养，进行了ALPK1、p-IκBα、p65、p-p65和ICAM1的蛋白质印迹分析；（e）通过免疫荧光测定法测量细胞中NF-κ B p65的分布，比例尺20 μm；（f-g）siRNA转染的HCT116细胞与具核梭杆菌或PBS对照共培养，进行粘附试验（f）和迁移试验（g）；在18小时后观察迁移的细胞，比例尺100 μm；（h-i）质粒转染ALPK1敲除的HCT116细胞用于蛋白质印迹分析（h）和粘附试验（i），比例尺，100 μm；数据显示为平均值±SD，** P< 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001。

6  具核梭杆菌丰富度过高与CRC患者ALPK1和ICAM1的高表达相关，表明了不好的临床结果

最近的研究表明，与正常组织相比，结直肠癌组织中具核梭杆菌的丰富度显著增加。为了在结肠内建立高丰富度具核梭杆菌环境，我们给预先给药抗生素3天的C57BL/6小鼠灌胃具核梭杆菌或PBS（图6a）。处理15天后处死小鼠，取出结肠进行试验分析。定量RT-PCR分析表明，经具核梭杆菌处理的结肠组织中具核梭杆菌丰富度显著增加，表明模型构建成功（图6b）。值得注意的是具核梭杆菌显著增加了ICAM1的表达（图6c-d）。此外，我们还建立了一个AOM/DSS诱导的CRC模型，同时进行具核梭杆菌、大肠杆菌或PBS对照处理（补充图5a-b）。定量RT-PCR分析显示，与大肠杆菌或PBS对照相比，具核梭杆菌处理的小鼠原位肿瘤组织中ALPK1和ICAM1水平显著上调（补充图5c-d）。这些结果证实，小鼠结肠组织中具核梭杆菌的过量导致体内ALPK1和ICAM1的上调。为进一步研究具核梭杆菌/ALPK1/ICAM1的临床意义，我们采用定量RT-PCR分析98例配对的新鲜CRC组织及癌旁非肿瘤组织（队列1）中具核梭杆菌丰富度及ALPK1、ICAM1的表达情况。与非肿瘤组织对照相比，CRC组织中具核梭杆菌的相对丰富度更高（补充图5e）。我们根据CRC组织中具核梭杆菌的水平将这些患者（n = 98）分类，将丰富度前1/2患者定义为高具核梭杆菌组（n = 49），其余的1/2患者定义为低具核梭杆菌组（n = 49）。值得注意的是，我们发现ALPK1和ICAM1的表达在高具核梭杆菌组中显著升高（图6e-f）。同样，CRC肿瘤组织中具核梭杆菌相对丰度与ALPK1水平呈正相关（补充图5f），与ICAM1水平同样呈正相关（补充图5g）。此外，在队列1和癌症基因组图谱（TCGA）数据库中，ICAM1的mRNA水平与ALPK1表达呈正相关（图6g，补充图5h）。更为重要的是，有淋巴结转移的CRC患者肿瘤组织与无转移患者相比，ICAM1呈上调趋势，这表明ICAM1与CRC患者晚期淋巴结转移呈正相关（图6h）。

为了进一步探究ALPK1和ICAM1在CRC远处转移患者中的临床意义，我们通过IHC分析（组织阵列队列2）证实了ALPK1和ICAM1在人CRC组织阵列中的表达。重要的是，ALPK1或ICAM1的高表达与肝转移阳性显著相关（图6i-j），ICAM1的蛋白质水平与ALPK1表达呈正相关（补充图5i）。此外，我们对队列2中的患者进行了随访，并分析了ALPK1和ICAM1表达情况与患者预后的相关性。Kaplan-Meier分析显示ALPK1或ICAM1的高表达与CRC患者的较短存活时间显著相关（图6k-1）。为了进一步确定具核梭杆菌在CRC转移中的作用，我们对32例淋巴结转移阳性（N1 + N2）和40例无淋巴结转移（N0）的CRC患者粪便样品中具核梭杆菌的相对丰度进行了定量（队列3）。正如预期的那样，在淋巴结转移阳性的CRC患者中，具核梭杆菌的水平特别高（图6m）。同时，与正常对照组相比，CRC患者的粪便中富含具核梭杆菌（补充图5j）。综上所述，我们的结果表明，在CRC组织中，具核梭杆菌的过量与ALPK1和ICAM1的高表达有关。此外，具有高水平具核梭杆菌、ALPK1或ICAM1的患者出现不良临床结果的风险更高，这对其临床管理具有重要意义。

图6. 具核梭杆菌丰富度过高与CRC患者ALPK1和ICAM1的高表达相关，表明了不好的临床结果。（a）用抗生素预处理的C57BL/6小鼠每天通过管饲法喂食具核梭杆菌或PBS对照，并在处理15后天处死；（b）定量RT-PCR分析上述处理的小鼠结肠组织中具核梭杆菌的相对丰度（n = 6），数据标准化为Universal Eubacteria 16S；（c）定量RT-PCR分析小鼠（n = 6）结肠组织中ICAM1的mRNA表达情况；（d）小鼠的结肠组织中ICAM1蛋白表达情况的具有代表性IHC图像；（e-f）定量RT-PCR分析队列1中由具核梭杆菌丰富度分为两组的ALPK1（e）和ICAM1（f）表达情况；（g）队列1中ALPK1和ICAM1相对mRNA水平的相关性；（h）队列1中不同淋巴结转移阶段CRC患者ICAM1的相对mRNA水平；（i-j）队列2中有无肝转移的CRC患者ALPK1（i）和ICAM1（j）的IHC分析，具有代表性图片见左图，比例尺50 μm；（k-l）队列2中CRC患者ALPK1（k）和ICAM1（l）表达情况的Kaplan-Meier生存曲线；（m）队列3中淋巴结转移阳性（N1+N2，n = 32）或无转移（N0，n = 40）的CRC患者粪便中具核梭杆菌的相对丰度；数据显示为平均值±SD，** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001。

讨论

越来越多的研究结果表明，肠道微生物及其代谢产物在结直肠肿瘤发生中发挥了重要作用。在本研究中，我们分析了CRC患者的粪便代谢产物和微生物组，并将其与癌症前期的CRA患者和健康受试者的粪便代谢产物和微生物组进行了比较分析。我们的结果证明了关键的代谢途径在CRC发病过程中被破坏。综合代谢组和微生物组分析表明，CRC相关细菌和代谢产物之间的相互作用随着CRC的发展而改变。重要的是，我们证明了除了细菌外，粪便代谢产物在非侵入性诊断CRC的潜力。

在这项研究中，我们首次揭示了具核梭杆菌可以增强CRC细胞与细胞间粘附能力，促进CRC细胞与内皮细胞的粘附，促进CRC细胞外渗和转移，为控制CRC细胞转移提供了一种新的微生物群-宿主相互作用模型（图7）。从机制上讲，核梭杆菌处理通过我们新鉴定的模式识别受体ALPK1激活CRC细胞的NF-κB信号，从而促进ICAM1的表达，对于核梭杆菌诱导的CRC细胞-内皮细胞黏附和转移至关重要。宏基因组和转录组分析表明，肠道微生物群，例如具核梭杆菌、Akkermansia muciniphila和Streptococcus thermophilus参与了CRC的发展。最近的研究中，在转移性病灶中检测到具核梭杆菌的存在，表明它可能促进结直肠癌的转移。有研究表明，具核梭杆菌通过激活KRT7 -AS、上调CARD3激活自噬、诱导具核梭杆菌感染的结直肠癌细胞产生的IL-8和CXCL1或外泌体促进结直肠癌转移。然而，肿瘤转移是一个极其复杂的过程，包括癌细胞脱离原发肿瘤，进入血液循环，黏附内皮细胞并外渗，到达远端形成可见的转移性病灶。肿瘤细胞与内皮细胞的直接相互作用是跨内皮细胞侵袭和定植的关键步骤。调节黏附相关分子的表达可能是改善CRC预后的有效策略。本研究首次发现，具核梭杆菌在体内外均增强了CRC细胞与内皮细胞的黏附，这是具核梭杆菌诱导的CRC细胞与内皮细胞黏附促进CRC转移的新型串扰。在本研究中，我们分析了具核梭杆菌促进CRC细胞与内皮细胞粘附的机制。在我们的RNA测序结果中鉴定了细胞黏附相关基因与具核梭杆菌上调基因之间的ICAM1重叠，作为具核梭杆菌的直接下游靶点。细胞表面黏附分子ICAM1可促进胰腺导管腺癌、肝细胞癌和结直肠癌的发展。我们发现下调ICAM1在体内外均可降低具核梭杆菌诱导的CRC细胞与内皮细胞黏附和转移的促进作用。

图7. 具核梭杆菌诱导的ALPK1/NF-κB/ICAM1轴调控CRC转移的示意图。肠道中大量的具核梭杆菌通过新发现的模式识别受体ALPK1激活CRC细胞的NF-κB信号，从而促进ICAM1的表达，这对于具核梭杆菌诱导的CRC细胞内皮细胞黏附、外渗和转移至关重要。

此外，我们试图揭示具核梭杆菌调节ICAM1的机制。我们基于RNA测序结果的KEGG分析表明，NF - κ B通路被具核梭杆菌处理激活。同样，有研究也证实了具核梭杆菌感染细胞后NF - κ B通路的激活。此外，在CRC细胞表面TLR4的识别可能参与了NF - κ B信号通路的持续激活。然而，有研究表明，具核梭杆菌通过FadA、Fap2和FomA等毒力因子黏附和侵袭上皮细胞。此外，最近的研究通过荧光显微镜和流式细胞术证实了具核梭杆菌对HCT116细胞的侵袭能力，表明具核梭杆菌可能存在其他途径激活NF - κ B通路。有趣的是，近期的一项研究发现ALPK1是微生物诱导NF - κ B激活的关键中介，是识别α螺旋内磷酸化位点的非典型激酶家族α激酶的成员。一般认为ALPK1接受了革兰阴性菌中存在的ADP- Hep信号。ALPK1对ADP- Hep的识别代表了先天感知的一种通用形式，介导对多种细菌病原体的免疫应答。在本研究中，我们发现具核梭杆菌能够诱导ALPK1的表达并持续激活NF - κ B信号通路，沉默ALPK1能够抑制具核梭杆菌感染引起的NF - κ B活化和ICAM1上调。此外，我们的结果表明，与其他革兰氏阴性菌相比，具核梭杆菌在ALPK1/NF-κB/ICAM1通路上表现出明显的激活作用。ALPK1/NF - κ B/ICAM1是具核梭杆菌感染的特异性途径。然而，我们并没有对具核梭杆菌激活ALPK1通路的详细机制进一步研究。有研究报道了类似的方式，幽门螺杆菌通过Ⅳ型分泌系统（T4SS）激活ALPK1 / NF-κB轴。研究具核梭杆菌如何刺激CRC细胞ALPK1的表达，进而影响NF-κB通路，具有重要意义。

此外，我们发现具核梭杆菌和ICAM1/ALPK1在肿瘤转移的CRC患者中高度富集。此外，具核梭杆菌的相对丰度与CRC组织中ICAM1/ALPK1的水平呈正相关，ICAM1/ALPK1的高表达与CRC患者的存活时间缩短显著相关。最近的研究报道，具核梭杆菌通过调节Wnt/β-catenin通路、NF-κB通路、自噬、葡萄糖代谢等促进CRC的发生。ALPK1/NF-κB/ICAM1轴至少可以在一定程度上解释具核梭杆菌处理促进了CRC的转移。然而，其他机制可能涉及具核梭杆菌诱导的CRC细胞和内皮细胞之间的相互作用，以及随后的CRC转移。由于具核梭杆菌的丰富度与CRC转移的风险相关，因此测量具核梭杆菌丰度可能是预测患者预后的有效方法。我们的研究结果支持这样的假设：即靶向具核梭杆菌、宿主上皮ICAM1表达和/或ALPK1可能提供阻断具核梭杆菌诱导的CRC转移并创造诊断机会的方法。总而言之，我们的研究结果为CRC转移中具核梭杆菌调节细胞间分子ICAM1的分子机制提供了重要的见解。具核梭杆菌通过ALPK1激活诱导NF-κB 通路，导致ICAM1上调并增强CRC 细胞-内皮细胞粘附和转移。体外和体内试验结果表明了具核梭杆菌、ICAM1或ALPK1在CRC患者中具有促转移作用，因此可以很好地利用针对具核梭杆菌、ICAM1和/或ALPK1的潜在治疗策略。