编译：微科盟索亚，编辑：微科盟索亚、江舜尧。
导读 研究背景：肠道微生物群通过微生物及其代谢产物参与结直肠癌（CRC）的发病。微生物相关代谢产物在结直肠癌发生中的重要性表明，沿着腺瘤到癌过程研究肠道代谢组的变化，以确定其在结直肠癌发病机制中的作用具有重要意义。迄今为止，如何以及哪些微生物和代谢产物相互作用促进早期 CRC发生尚不清楚。本研究的目标是确定肠道微生物相关代谢产物及其与结直肠癌发生的联系。
结果：我们对386例受试者的粪便样本进行代谢组学和宏基因组学分析，其中包括118例CRC患者，140 例结直肠腺瘤（CRA）患者和128例正常对照（NC）者。
通过偏最小二乘判别分析和主成分分析，我们发现NC 组、CRA 组和 CRC 组之间肠道代谢产物存在差异。在改变的代谢产物中，正缬氨酸和肉豆蔻酸呈现从NC组到CRA组再到CRC组上升趋势。与 CRC相关的代谢产物富集于 支链氨基酸、芳香族氨基酸以及氨酰-tRNA生物合成途径 。
此外，代谢产物标志物（20种代谢产物）将可以鉴别NC组与CRC组，曲线下面积（AUC）为0.80，以及CRC组与CRA组，AUC为0.79 。代谢组学和宏基因组学的综合分析表明， CRC 相关代谢产物和细菌之间的相关性在CRC阶段发生了改变；一些关联强度表现出增强或减弱，而有些相关性则由负相关向正相关转变，反之亦然。 肠道细菌与代谢产物标志物的组合提高了它们的诊断能力，区分CRC组与NC组，AUC：0.94；CRC组与CRA组，AUC：0.92；CRA组与NC组，AUC：0.86，表明了早期诊断结直肠肿瘤的潜力。
结论：本研究强调了结直肠肿瘤发生阶段潜在的早期驱动代谢产物。综合代谢产物和微生物组分析表明，肠道代谢产物及其与肠道微生物的相互作用在结直肠癌发生过程中会受到干扰。除细菌外，粪便代谢产物还可用于结直肠肿瘤的非侵入性诊断。
微信视频预览查看
论文ID
原名：Altered gut metabolites and microbiota interactions are implicated in colorectal carcinogenesis and can be non-invasive diagnostic biomarkers
译名：肠道代谢产物和微生物相互作用的改变与结直肠癌的发生有关，并且可以成为非侵入性诊断的生物标志物
期刊：Microbiome
IF：14.65
发表时间：2022.02
通讯作者：于君
通讯作者单位：香港中文大学
DOI：10.1186/s40168-021-01208-5
实验设计
本研究共纳入386名受试者，在接受标准结肠镜检查后，386名受试者被分为118例结直肠癌（CRC）患者，140例结直肠腺瘤（CRA）患者和128例正常对照（NC）者。记录所有受试者的临床特征指标，采集粪便样本；有CRA和CRC受试者在收集粪便样本时均有完整的结直肠病变。对粪便样本进行宏基因组测序分析以及代谢组分析。对宏基因组测序数据和代谢组数据进行综合分析，鉴定区分不同组的生物标志物及其鉴定性能。
结果
1 在结直肠癌（CRC）不同阶段肠道代谢产物的改变
我们的研究包括386名受试者，即118名结直肠癌（CRC）患者，140名结直肠腺瘤（CRA）患者和128名正常对照（NC）者。使用GC-TOFMS从受试者粪便样本中共检测出97种代谢产物。PLS-DA（图1A）和PCA（图 1B）图显示CRC组、CRA组和NC组之间的肠道代谢产物存在差异（PERMANOVA，p = 0.001），表明了在结直肠癌发生中的肠道代谢产物的改变。
为了确定在CRC发展的各个阶段显著改变的重要代谢产物，我们在不同组之间进行了成对的比较。与CRC组相比，NC组的17种代谢产物发生了显著的改变；其中L-丙氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-天冬氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-丝氨酸、肉豆蔻酸、苯乳酸、氧代戊二酸、L-苯丙氨酸、L-α-氨基丁酸、苯乙酸、棕榈油酸、3-氨基异丁酸和正缬氨酸在NC组富集。相比之下，与NC组相比，CRC组患者的丁酸含量降低（图1C和图S3A，表S2）。
与CRC组相比，CRA组患者36种代谢产物差异显著，其中5-十二碳烯酸、亚油酸、α-亚麻酸和丁酸的含量降低（图1D和图S3B，表S3）。有趣的是，与NC组和CRA组受试者相比，L-丙氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-天冬氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-丝氨酸、肉豆蔻酸和苯基乳酸在CRC组中富集（图1C和D，图S3）。
此外，我们还发现正缬氨酸和肉豆蔻酸显示出从NC组到CRA组再到CRC组的增加趋势（图S4），这表明它们对结肠肿瘤发生有潜在的帮助。为了深入了解每两组之间显著改变代谢产物的功能，我们进行了代谢集富集分析（Metabolite Set Enrichment Analysis，MSEA）。我们观察到与支链氨基酸（BCAA）代谢相关的通路在导致CRC的各个阶段存在差异。与NC组（图1E）和CRA组（图1F）相比，CRC组中前4个富集的代谢途径是（1）氨酰-tRNA生物合成；（2）缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成；（3）苯丙氨酸代谢和（4）苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，这表明在结直肠癌发生过程中，除了个体代谢产物外，代谢途径也发生了改变。
图1. 代谢组学数据概况及代谢通路富集分析。（A）CRC组、CRA组和NC组的主成分分析（PCA）；（B）CRC组、CRA组和NC组的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）；（C）CRC组和NC组之间17种显著改变的代谢物标准值热图；（D）CRC组和CRA组之间36种显著改变的代谢物标准值热图；使用来自成对PLD-D分析和 Wilcoxon秩和检验的VIP值确定显著改变的代谢物，其中VIP > 1和p < 0.05；（E）CRC组和NC组之间17种差异代谢物的代谢途径富集分析；（F）CRC组和CRA组之间36种差异代谢物的代谢途径富集分析；CRC，结直肠癌；CRA，结直肠腺瘤；NC，健康对照。
2 作为结直肠癌（CRC）诊断标志物的代谢产物
我们进一步研究了肠道微生物相关代谢产物在CRC的非侵入性诊断中的潜在应用价值。使用已鉴定的显著改变代谢产物（图1C和D），我们建立逐步逻辑回归模型来鉴别不同的受试组。我们的模型选择了20种代谢产物作为标志物，可以将NC组受试者与CRC组受试者区分开来，曲线下面积（AUC）为0.80（图2A）。相同的20个标志物可以将CRC组与CRA组区分开来，AUC为0.7889（图2B），CRA组与NC组的AUC为0.661（图2C）。为了区分CRA组与NC组，我们鉴定了11种代谢产物标志物，AUC为0.6853（图2D）。
这11种代谢产物标志物可以区分CRA组与CRC组以及CRC组与NC组，AUC分别为0.7464和0.6764（图2E和F）。CRC组可以通过13种代谢产物标志物与CRA组区分开来，AUC为0.81（图2G）。使用这13种代谢产物标志物，区分CRC组与NC组以及CRA组与NC组，AUC分别为0.7168和0.6648（图2H和I）。
同时，我们还通过10倍交叉验证的随机森林对识别标记的可靠性进行了验证（图S6）。此外，调整临床特征，即年龄、性别和肥胖，改善了所有代谢标志物的可靠性，AUCs约增加了8%（图S5）。
图2. 用于区分成对的CRC组、CRA组和NC组的代谢标志物。（A）用于区分CRC组和NC组的20种代谢物标记的接受者操作特征（ROC）分析；（B）用区分CRC组与NC组的20个代谢物标志物来区分CRA组和NC组的ROC分析；（C）用区分CRC组与NC组的20个代谢物标志物来区分CRC组和CRA组的ROC分析；（D）用于区分CRA组和NC组的11种代谢物标志物ROC分析；（E）用区分CRA组和NC组的11个代谢物标志物来区分CRC组和NC组的ROC分析；（F）用区分CRA组和NC组的11个代谢物标志物来区分CRC组和CRA组的ROC分析；（G）用于区分CRA组和CRC组的13种代谢物标志物ROC分析；（H）用区分CRA组和CRC组的13个代谢物标志物来区分CRC组和NC组的ROC分析；（I）用区分CRA组和CRC组的13个代谢物标志物来区分CRA组和NC组的ROC分析；CRC，结直肠癌；CRA，结直肠腺瘤；NC，健康对照。
3 作为结直肠癌（CRC）诊断标志物细菌物种
肠道菌群失调与结肠肿瘤发生有关。我们使用所有受试者的粪便鸟枪宏基因组学序列数据，进一步研究了细菌在CRC发展的各个阶段显著改变的细菌。通过NMDS β多样性分析，表明了CRC组、CRA组和NC组之间的细菌群落存在差异（p = 0.001；图3A）。与NC组（图3B）和CRA组（图3C）的受试者相比，Peptostreptococcus stomatis、Fusobacterium nucleatum、Parvimonas micra、Peptostreptococcus anaerobius和Bacteroides fragilis再CRC组中显著富集；而与NC组（图3B）和CRA组（图3C）的受试者相比，Coprobacter fastidosus、Eubacterium ventriosum、Roseburia interinalis和Roseburia inulivorans再CRC组患者中显著减少。Leptotrichia buccalis和Prevotella veroralis会沿着NC组到CRA组再到CRC组呈现增加的趋势（图S7A），而Lachnospiraceae bacterium1_4_56FAA和Eubacterium dolichum则会沿着NC组到CRA组再到CRC组呈现减少的趋势（图S7B）。
此外，我们使用逐步逻辑回归模型来识别具有潜在的诊断价值细菌物种。结果发现，F. nucleatum、P. anaerobius、P. micra、R. inulinivorans、E. corrodens和X. perforans可以将CRC组与NC组区分开来，AUC为0.905，与我们之前的研究结果相一致（图3D）。这6种细菌标志物将可以CRC组与CRA组区分开来，AUC为0.8877（图S8A），而区CRA组与NC组的AUC为0.602（图S8B）。CRA组与NC组可以被14种细菌物种区分开来，AUC为0.8408（图3E）。这14种细菌标志物还可以区分NC组与CRC组，AUC为0.8207（图S8C）和CRA组与CRC组，AUC为0.8925（图S8D）。包括 F. nucleatum在内的6种细菌标志物可以区分CRC组与CRA组，AUC为0.9071，（图3F）。这6种细菌标志物还可以区分CRC组与NC组以及CRA组与NC组，AUC分别为0.8545和0.7188（图S8E和F）。我们通过10倍交叉验证的随机森林进一步验证了细菌标志物。与代谢产物标志物相比，通过调整年龄、性别和肥胖，细菌标志物AUC没有得到显著的改善（图S9和图S10）。
图3. 宏基因组数据概况和诊断性能。（A）CRC组、CRA组和NC组细菌物种丰度基于Bray-Curtis距离的非度量多维标度（NMDS）分析；（B）CRC组和NC组之间44种丰富度差异的细菌物种热图；（C）CRC组和CRA组之间44种丰富度差异的细菌物种热图；使用Wilcoxon秩和检验确定相对丰富度差异的物种；FDR调整后的p < 0.05，相对丰度的平均值 > 0.001和流行率 > 0.4；（D）用于区分CRC组和NC组的6种细菌物种的接受者操作特征（ROC）分析；（E）用于区分CRA组和NC组的14种细菌物种的ROC分析；CRC，结直肠癌；CRA，结直肠腺瘤；NC，健康对照。
4 细菌标志物提高了代谢产物标志物的诊断能力
为了探究是否可以更好地区分结直肠癌不同的发生阶段，我们通过逐步逻辑回归模型，将代谢产物标志物和细菌标志物结合起来。11种代谢产物标志物（2-羟基丁酸、γ-氨基丁酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、氧代己二酸、氧代戊二酸、棕榈油酸、苯乙酸和庚二酸）和6细菌物种（F. nucleatum、P. anaerobius、P. micra、R. inulinivorans、E. corrodens和X. perforin）可以区分NC组与CRC组，AUC达到了更高的0.9417（图4A），而仅使用代谢产物标记的AUC为0.905。
代谢产物标志物和细菌标志物的组合还可以将CRA组与NC组以及CRC组与CRA组区分开来，AUC分别为0.6728和0.92（图S11A和B）。L-天冬酰胺和苯乳酸与14种区分CRA组与NC组细菌标志物的结合可以将AUC从0.8408提高到0.8759（图4B）。这样代谢产物与细菌的组合可以区分NC组与CRC组，AUC为0.8195（图S11C）以及CRA组与CRC组，AUC为0.8976（图S11D）。此外，α-亚麻酸、L-高丝氨酸、苯乙酸和苯乳酸与6种区分CRC组与CRA组的细菌标志物的结合可以将AUC从0.9071提高到0.9375（图4C）。用于区分CRC组与CRA组的10种代谢产物和细菌标志物的组合也可以将CRC组与NC组以及CRA组与NC组分类，AUC分别为0.8723和0.7499（图 S11E 和 S11F），这证实了代谢产物与细菌相结合早期诊断CRA的潜力。
图4. 用于区分成对的CRC组、CRA组和NC组的细菌和代谢物标志物的组合。（A）用于区分CRC组和NC组的6种细菌物种和11种代谢物组合的接受者操作特征（ROC）分析；（B）用于区分CRA组和NC组的14种细菌物种和2种代谢物组合的ROC分析；（C）用于区分CRA组和CRC组的6种细菌物种和4种代谢物组合的ROC分析；CRC，结直肠癌；CRA，结直肠腺瘤；NC，健康对照。
5 在结直肠癌（CRC）中，代谢产物和细菌之间的相互作用发生了改变
为了探究显著改变的代谢产物和丰富度显著差异的细菌物种之间潜在的相互作用，我们使用零膨胀负二项（Zero-inflated Negative Binomial，ZINB）回归进行了关联分析。在CRC阶段的相互作用分布显著不同（图S12）。此外，一些相互作用随着CRC进展呈增加或减少趋势，而一些相互作用则从负相关转变为正相关（图S13A），反之亦然（图S13B）。
在鉴别CRC组与NCZ组的6种细菌物种中，P. anaerobius与甘氨酸之间的相关性显著，且随着CRC的发展而增加（p < 0.05，表 S4），而P. anaerobius与肉豆蔻酸之间的相关性显著，但会随着CRC的发展而降低。P. micra与亚油酸和L-缬氨酸显著相关，并且相关性联都遵循从NC组、到CRA组，再到CRC组的下降趋势。在区分CRA组和NC组的14种细菌标志物中，Clostridium symbiosum与在CRC组富集的L-缬氨酸和L-高丝氨酸显著相关，并且相关性的强度随着CRC的发展而增加。此外，Synergistes sp.3_1_syn1与L-天冬氨酸和L-酪氨酸显著相关，并且相关性会随着CRC的发展均呈下降趋势。Porphyromonas gingivalis与γ-氨基丁酸之间以及Prevotella nigrescens与L-天冬酰胺之间的也存在显著的相关性，并且随着CRC的发展而降低（表S4）。
我们进一步研究了与CRC相关的代谢产物之间的相互作用。在CRC组减少的代谢产物丁酸与在CRC组富集的代谢产物（包括庚二酸、L-脯氨酸、L-蛋氨酸和L-异亮氨酸）显示出独有的相互作用。此外，CRC组富集的代谢产物之间存在很强的共现关系，例如L-脯氨酸、L-天冬氨酸、L-蛋氨酸、氧代戊二酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、γ-氨基丁酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸和 L-酪氨酸，这证明了它们在CRC发生过程中的潜在作用（图S14）。综上所述，这些结果表明肠道代谢产物和细菌之间存在显著的相关性，这些相关性会随着结直肠癌发生的阶段而发生变化。
讨论
越来越多的研究结果表明，肠道微生物及其代谢产物在结直肠肿瘤发生中发挥了重要作用。在本研究中，我们分析了CRC患者的粪便代谢产物和微生物组，并将其与癌症前期的CRA患者和健康受试者的粪便代谢产物和微生物组进行了比较分析。我们的结果证明了关键的代谢途径在CRC发病过程中被破坏。
综合代谢组和微生物组分析表明，CRC相关细菌和代谢产物之间的相互作用随着CRC的发展而改变。重要的是，我们证明了除了细菌外，粪便代谢产物在非侵入性诊断CRC的潜力。 代谢组学具有诊断癌症（包括CRC）的潜力。我们的代谢组学分析表明，与CRA组和NC组受试者相比，L-丙氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-天冬氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-丝氨酸、肉豆蔻酸和苯乳酸在CRC患者中富集。氨基酸在分子生物合成的步骤中发挥着重要作用，它们维持着氧化还原平衡，并作为能量来源。
丰富的氨基酸也被认为是促进癌细胞增殖的关键因素。氨基酸衍生物可以影响免疫反应和调节表观遗传学。因此，据报道它们与致癌作用有关。在本研究中，被确定为与CRC相关的丙氨酸已被证明是一些胃肠道癌症的重要生存信号。例如，基质细胞分泌TCA循环所需的丙氨酸，促进胰腺癌的生长。
此外，甘氨酸可以为核酸、脂质和蛋白质的合成提供必要的前体，从而支持癌细胞的生长。有研究表明，脯氨酸生物合成上调并与癌症预后不良有关，这支持了我们在本研究中的结果。有趣的是，发现正缬氨酸和肉豆蔻酸从NC组到CRA组再到CRC组呈增加趋势。正缬氨酸是缬氨酸的异构体，它与巨噬细胞对乳腺肿瘤细胞的细胞毒活性有关。还有研究表明，正缬氨酸还可以通过抑制核糖体蛋白S6激酶beta-1部分促进组织再生和肌肉生长。肉豆蔻酸是一种常见的不饱和脂肪酸，与人类的高胆固醇水平呈正相关，据报道会增加患乳腺癌的风险。这两种代谢产物在结直肠癌发展过程中的增加趋势表明了它们在结直肠肿瘤发生中的潜在作用，值得进一步研究。在本研究中，CRC组患者中唯一减少的代谢产物是丁酸，丁酸是一种由膳食纤维在大肠中发酵产生的短链脂肪酸。
研究已经证明，丁酸通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡对结直肠癌具有保护作用，进一步支持了我们在本研究中的发现。 代谢通路富集分析表明，与健康受试者相比，CRC组患者和腺瘤患者的氨酰-tRNA生物合成、芳香族氨基酸生物合成和BCAAs代谢发生了显著改变。氨酰-tRNA生物合成需要氨酰-tRNA合成酶，这是一类重要的酶，具有进化上保守的蛋白质合成机制，其中一些与结直肠肿瘤的发展呈正相关。在本研究中，与CRA组和健康受试者相比，包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸在内的BCAA在CRC组中上调。
这些BCAAs是癌症发展的必需营养素，被肿瘤细胞用于各种生物合成途径和作为能量来源。此外，我们还观察到肠道微生物在包括酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在内的芳香族氨基酸的代谢中发挥着积极的作用。有研究表明，调节血清芳香族氨基酸水平会破坏无菌小鼠的肠道通透性和全身免疫。这表明本研究中观察到的芳香族氨基酸生物合成失调可能通过受损的肠道屏障诱导CRC的发生。此外，有研究表明，色氨酸代谢途径与通过宿主-肠道微生物界面治疗胃肠道疾病有关。在本研究中发现在CRC组患者中上调的苯丙氨酸是一种必需氨基酸，可能有助于癌细胞的增殖和迁移。我们的结果得到了前人研究结果的支持，表明BCAAs、芳香族氨基酸和苯丙氨酸代谢组学途径可能在结直肠癌发生中起重要作用。 我们进一步探讨了肠道微生物相关代谢产物在CRCD非侵入性诊断中的潜在应用。为了区分CRC组与NC组和CRA组，分别鉴定了20和13个代谢产物标志物，AUC均约为0.80。6个细菌物种可以将CRC组与NC组和CRA组区分开来，AUC分别为0.91和0.89。
通过代谢产物和细菌标志物的结合，11个代谢产物和6个细菌物种（F. nucleatum、P. anaerobius、P. micra、R. inulinivorans、E. corrodens和X. perforans）可以得到更好的鉴别能力（AUC=0.94）。有趣的是，我们观察到4种代谢产物的组合（α亚油酸、 l- 高丝氨酸、苯乳酸和苯乙酸），以及细菌标志物（F. nucleatum，P. anaerobius, P. micra，R. inulinivorans，E. corrodens和X. perforans）可以区分NC组与CRA组，AUC为0.7499；这表明了在健康患者中早期诊断结直肠腺瘤的潜力。此外，我们的相关性分析表明，与NC组和CRA组受试者相比，CRC组患者的代谢产物和细菌之间的相关性存在显著差异。有些相关性会随着CRC发展呈现增加或减少的趋势，还有些相关性从正相关转为负相关，反之亦然。值得注意的是，帮助癌细胞生长的甘氨酸与通过PI3K-Akt-NF-κB信号通路驱动CRC发展的P. anaerobius之间的相关性增加，这表明甘氨酸和P. anaerobius在CRC的发展中有潜在的合作。
此外，我们发现丰富度从健康受试者到腺瘤患者，再到结直肠癌患者增加的Clostridium symbiosum与CRC组富集的L-缬氨酸和L-高丝氨酸显著相关，并且相关性会随着CRC的发展而增加。总的来说，我们的结果表明肠道代谢产物和细菌之间存在显著的相互作用，这可能会影响结直肠癌的发生。 在本研究中的微生物相关代谢产物是基于代谢组学数据和人类肠道微生物相关代谢产物的化学性质。氯 甲酸烷基酯衍生方法用于GC-TOF/MS检测。由于胆汁酸的强极性，GC-MS响应较差。最近开发了用于特异性检测胆汁酸的新方法，其与CRC发生的关联将在未来的研究中进行。
总之，我们的综合代谢组和微生物组研究表明，肠道代谢产物和微生物组在结直肠癌发生的各个阶段会发生变化，代谢产物和细菌物种的结合可以增加非侵入性诊断结直肠癌和腺瘤的能力。本研究表明了CRC肿瘤发生过程中潜在的早期驱动代谢产物，并为进一步的实验提供了信息，以便开发更好的CRC诊断和预防策略。
